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O ensaio foi conduzido no Setor de Caprinocultura e as análises bromatológicas, no Laboratório de Nutrição Animal do Departamento de Zootecnia. As análises de amônia (NH3) ruminal e da atividade específica de produção de amônia (AEPA) pela microbiota ruminal foram realizadas no Laboratório de Anaeróbios do Departamento de Microbiologia e as de ácidos graxos voláteis (AGV) no líquido ruminal, no Laboratório de Cromatografia do Departamento de Química, todos da Universidade Federal de Viçosa - MG.
Foram utilizadas seis cabras multíparas, secas, fistuladas no rúmen (70 kg de PV). Os animais foram alimentados, durante os seis períodos experimentais, com a mesma dieta, composta de 67% de silagem de milho e 33% de concentrado à base de fubá de milho e farelo de soja (Tabela 1). A composição bromatológica da silagem de milho, do concentrado e da dieta total encontra-se na Tabela 2.
O experimento consistiu da adição na dieta de níveis crescentes de óleo de soja (0; 1,5; 3,0; 4,5; 6,0 e 7,5% da MS da dieta), extrato etanólico de própolis (0; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0 e 12,0 mL/animal/dia) e própolis bruta moída (0; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 e 6,0 g/animal/dia), conforme apresentado na Tabela 3, de modo que cada produto foi fornecido a duas cabras. Para obtenção do extrato da própolis, a própolis bruta (50% p/v) foi moída em solução alcoólica a 70% em água por um período de dez dias e, em seguida, foi filtrada em papel-filtro, conforme técnica descrita por Stradiotti Jr. et al. (2004).
Foram utilizados seis períodos experimentais de sete dias (seis para adaptação a cada nível de óleo de soja, de extrato etanólico de própolis e de própolis bruta moída e um dia para coleta de líquido ruminal e de amostras do volumoso e do concentrado fornecidos). Adotou-se o aumento gradativo do nível de óleo de soja, extrato etanólico de própolis e própolis bruta moída com o avanço dos períodos experimentais, visto que não há conhecimento sobre o nível máximo tolerável (esta é a segunda pesquisa realizada com o uso de própolis e a primeira na qual foram testados níveis crescentes desse produto na alimentação de ruminantes).
Os animais foram vermifugados e pesados antes do início do experimento e alojados em baias individuais para estudos de digestibilidade, providas de bebedouros automáticos e de comedouros. As dietas foram fornecidas à vontade, de modo que houvesse pelo menos 5% de sobras. Os animais foram alimentados individualmente às 8, 12 e 16h e receberam o concentrado juntamente com o volumoso. O óleo de soja, o extrato etanólico de própolis e a própolis bruta moída foram divididos em três porções diárias, adicionados diretamente sobre os alimentos no cocho às 8, 12 e 16h e misturados.
Nos períodos de adaptação e de coletas, foram feitas pesagens da silagem e do concentrado oferecidos e das sobras. As sobras de cada animal foram amostradas todos os dias, sendo preparadas amostras compostas referentes a cada período experimental para determinação dos teores de MS (a 105ºC), MO, PB e EE, utilizando-se as técnicas descritas por Silva (1998), e de fibra em detergente neutro (FDNcp), segundo Van Soest et al. (1991). As análises foram realizadas ainda nas amostras do volumoso e do concentrado.
Para determinação do pH, da concentração de amônia (NH3) e de ácidos graxos voláteis (AGV) no líquido ruminal, as amostras foram coletadas manualmente, via fístula de rúmen, e filtradas em gaze. Para a leitura imediata do pH no líquido ruminal, foi utilizado potenciômetro. Os tempos de coleta foram de 0, 3, 6 e 9 horas após a alimentação da manhã.
As amostras do líquido ruminal para análise das concentrações de amônia (NH3) foram colocadas em tubos eppendorf de 1,5 mL e centrifugadas a 5.200 x g por 10 minutos retirando-se o sobrenadante com uma seringa até completar outro tubo eppendorf para posterior congelamento. A concentração de amônia foi determinada pela técnica colorimétrica descrita por Chaney & Marbach (1962).
As amostras do líquido ruminal para análise de AGV foram colocadas em tubos eppendorf de 1,5 mL e centrifugadas a 13.000 x g por 20 minutos, retirando-se 500 µL do sobrenadante e colocando-os em tubos vial de 2 mL juntamente com 500 µL de ácido meta-fosfórico a 25%.
As análises dos líquidos sobrenadantes foram realizadas em cromatógrafo a gás, modelo Shimadzu GC/17A, com auto-injetor Shimadzu AOC17, que, por meio de um módulo de comunicação Shimadzu CBM - 101, foi acoplado a um microcomputador Pentium 100 com o software Class - GC10, versão 1.6.1.
Os AGVs foram separados em uma coluna NukolTM capilar, de sílica fundida (30 m x 0,25 mm x 0,25 mm Film Thikness, Supelco, Inc., Bellefonte, PA). O detector utilizado foi o de ionização de chama (FID). Como gás de arraste, utilizou-se nitrogênio e, para formação de chama, foram usados hidrogênio e ar sintético. Para determinação dos padrões de AGV, utilizou-se o kit de ácidos orgânicos Supelco.
A atividade específica de produção de amônia (AEPA) foi determinada pela microbiota ruminal, em amostras coletadas 3 horas após a alimentação da manhã, como descrito anteriormente, acondicionadas em frascos de vidro com tampa e mantidas em sala de incubação. As amostras ficaram em repouso durante 40 minutos para decantação e separação de partículas alimentares. Foram transferidos (em duplicata) 9 mL do líquido ruminal para tubos de incubação, que foram preenchidos com CO2 e vedados com rolha de borracha. No tempo zero (0), 1 mL de solução anaeróbica de Trypticase (BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD) foi adicionado aos tubos (15 g/L de concentração final), que foram incubados a 39ºC por 4 horas. O meio foi coletado (1,5 mL) imediatamente antes e após a incubação e armazenados a -15ºC para posterior estimação de amônia pela técnica colorimétrica proposta por Chaney & Marbach (1962).
A concentração de proteína bacteriana foi determinada pela técnica colorimétrica descrita por Lowry et al. (1951). O líquido sobrenadante (1,5 mL) foi centrifugado a 13.000 xg, por cinco minutos, sendo realizadas sucessivas ressuspensões e centrifugações do pellet bacteriano em solução de NaCl a 0,9% (p/v), seguidas do restabelecimento do volume final com solução fisiológica para 1,5 mL e do armazenamento em tubos eppendorf a -15ºC para posterior análise.
A AEPA foi determinada conforme Lana & Russell (1997) utilizando-se a seguinte fórmula: AEPA = (NH3 x 1.000.000)/proteína microbiana/min, em que AEPA = nmol NH3/mg proteína microbiana/minuto; NH3 = concentração final - inicial de amônia (mM); proteína microbiana = concentração inicial (mg/L); e min = tempo de incubação (minutos).
Foram realizadas análises de regressão para determinação do efeito dos níveis (seis) de óleo de soja (OLS), extrato etanólico de própolis (EEP) e própolis bruta moída (PBM) sobre os parâmetros avaliados, com duas repetições (cabras) por produto testado, totalizando 36 unidades experimentais. Foram feitos ainda testes de média, em um delineamento inteiramente casualizado, com quatro tratamentos (controle, OLS, EEP e PBM) e duas repetições, totalizando oito unidades experimentais. Cada unidade experimental do tratamento controle consistiu do cálculo da média dos dados de três cabras no primeiro período experimental, em que não houve inclusão de aditivos alimentares. As outras seis unidades experimentais utilizadas nos testes de médias (duas cabras em cada um dos produtos testados: OLS, EEP e PBM) consistiram da obtenção, por cabra, das médias provenientes dos cinco níveis de cada produto testado, excluindo o nível zero (0). Foram analisados os consumos de MS, MO, PB, EE, FDN e CNF, os teores de ácidos graxos voláteis ruminais (AGV) e de amônia ruminal (NH3), o pH ruminal e a atividade específica de produção de amônia (AEPA). As análises estatísticas foram feitas utilizando-se os procedimentos de regressão e GLM do MINITAB (Ryan & Joiner, 1994) a 5% de probabilidade.
Não houve efeito de aditivo alimentar (óleo de soja, extrato etanólico de própolis e própolis bruta moída) e interação aditivo ' nível de inclusão sobre os consumos de MS, MO, PB, FDN e CNF, as concentrações de AGV e NH3 ruminais, o pH e a atividade específica de produção de amônia (AEPA) pela microbiota ruminal.
Como não houve efeito de nível de aditivo alimentar, foram aplicados os testes de média conforme descrito anteriormente. As características relacionadas ao consumo não foram afetadas (P>0,05) pelos tratamentos, exceto o consumo de EE (P<0,01) no tratamento contendo óleo de soja (Tabela 4), que aumentou como resultado do efeito direto do uso de óleo de soja.
Os valores do consumo diário de MS observado foram inferiores aos obtidos por Gonçalves et al. (2001), de 2,33 a 2,35 kg para cabras não-lactantes recebendo 20 e 40% de concentrado, respectivamente, semelhante aos valores de consumo de FDN, que foram de 1,34 e 1,01 kg.
Não houve efeito de aditivo nem da interação aditivo ' tempo sobre o pH e a concentração de amônia ruminal. Entretanto, quando se utilizaram valores médios de todos os tratamentos nos tempos 0, 3, 6 e 9 horas, a concentração de amônia aumentou e o pH diminuiu em função do tempo de coleta de líquido ruminal (Figura 1). Desse modo, não houve estabilidade das condições ruminais com o fornecimento da alimentação três vezes ao dia nos horários de 8, 12 e 16 horas.
Os valores de pH de 6,6 a 5,6 no decorrer de 9 horas após a alimentação, para animais que receberam 33% de concentrado, foram inferiores aos observados por Gonçalves et al. (2001), que, em experimento com cabras leiteiras recebendo dietas compostas por diferentes relações volumoso:concentrado, observaram pH de 6,5 a 6,9 ao longo de 24 horas nos animais que receberam 40 e 20% de concentrado, respectivamente.
O pH ruminal médio observado foi de 6,2 e manteve-se, na maioria do tempo, acima de 5,9 (Figura 1). Segundo Russell & Dombrowski (1980), o crescimento das principais bactérias celulolíticas é comprometido em pH em torno de 6,0-6,1, sendo totalmente inibido em valores abaixo de 5,9.
A concentração média de amônia ruminal foi de 15,77 mg/dL e o valor mínimo observado foi de 10,6 mg/dL (Figura 1). Embora Mehrez & Ørskov (1976) tenham observado que a concentração mínima de amônia deve ser de 23 mg/dL de líquido ruminal para se obter taxa máxima de crescimento microbiano, estudos in vitro (Satter & Slyter, 1974) e in vivo (Satter & Roffler, 1975) demonstraram que a concentração mínima de amônia deve ser de 5 mg/dL de líquido ruminal para favorecer o crescimento microbiano. Do mesmo modo, Leng & Nolan (1984) verificaram que concentrações superiores a 5-10 mg/dL de líquido ruminal não aumentam a produção de proteína microbiana.
Não houve efeito dos tratamentos (P>0,05) sobre o pH e a amônia ruminais, a AEPA, as concentrações de acetato, propionato, butirato e ácidos graxos voláteis totais e a relação acetato:propionato (Tabela 5). Entretanto, há evidências de redução da relação acetato:propionato e da concentração de butirato no líquido ruminal pela adição de extrato etanólico de própolis.
Van Nevel & Demeyer (1988) observaram redução da concentração de NH3 ruminal em animais que receberam óleo na dieta. Embora a adição do óleo tenha reduzido a concentração de amônia (22,17%) em relação à dieta controle, não houve efeito estatístico atribuído ao elevado erro-padrão. O efeito de lipídios na redução da concentração de NH3 ruminal pode ser atribuído à ação sobre os protozoários e à redução na população de bactérias desaminadoras (Van Nevel & Demeyer, 1988).
Stradiotti Jr. et. al. (2004) verificaram que o extrato de própolis não afetou o consumo de MS, o pH e as concentrações de amônia e de proteína microbiana no líquido de rúmen, mas inibiu a AEPA pelos microrganismos ruminais. Os valores de AEPA apresentados por esses autores foram 11,65 e 8,10 nmol/mg PM/min para os tratamentos ausência e presença de extrato etanólico de própolis, respectivamente, os quais divergem dos verificados neste experimento (28,00 e 36,17 nmol/mg PM/min). Provavelmente esses resultados decorreram da utilização de própolis de origens diferentes ou das modificações na metodologia de extração.
Lavezzo et al. (1998) observaram no fluido ruminal de ovinos concentrações médias de acetato de 37,05; 35,28 e 38,11 milimolar (mM) nos tempos 1, 3 e 6 horas após a alimentação, respectivamente, inferiores às registradas neste estudo (Tabela 5). Ítavo et al. (2000), utilizando feno de aveia e silagem de bagaço de laranja na alimentação de ovinos, verificaram concentrações médias para acetato, propionato e butirato de 40,83; 12,77 e 5,77 mM, respectivamente, próximas às descritas na Tabela 5.
O uso de própolis e óleo de soja na dieta não afetou o consumo de MS e de nutrientes nem alterou os parâmetros de fermentação ruminal em cabras leiteiras. Sugere-se a realização de mais pesquisas com adição de própolis na dieta de animais ruminantes, pois existem evidências de que seu fornecimento a esses animais reduz a relação acetato:propionato e a concentração de butirato no líquido ruminal.
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Eduardo da Costa EifertIII;
Marcus Vinícius Morais de OliveiraIV;
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IDZO/UFV - CEP: 36571-000 - Viçosa-MG. Bolsista do CNPq
IIMestre em Zootecnia
IIIEmbrapa CNPAF - Santo Antônio de Goiás-GO
IVUEMS - Aquidauana-MS
VUFES - Alegre-ES
VIDoutoranda em Zootecnia - UFV - CEP: 36571-000 - Viçosa-MG
Revista Brasileira de Zootecnia v.36 n.1 Viçosa jan./fev. 2007
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