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O material vegetal utilizado foi proveniente de cultivares de Prunus sp., propagadas nos viveiros do Departamento de Fitotecnia da Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel.
A extração e análise das peroxidases (UE/min/g de tecido - peso fresco) e compostos fenólicos totais (mg/g de tecido - peso fresco) foram executadas no Laboratório de Fisiologia Vegetal da Embrapa Clima Temperado, localizado na BR 392 Km 72, em Pelotas, RS.
Quantificou-se a atividade das peroxidases (PO) e dos fenóis totais (FE) na casca e no lenho (fator B) dos porta-enxertos de pessegueiros Aldrighi, Capdeboscq, GF 677 e Okinawa e nas ameixeiras Mirabolano e Marianna comum (fator A), em plantas antes da enxertia com aproximadamente oito meses de idade e diâmetro do caule de 1cm. As amostras do tecido vegetal foram retiradas a 20cm do colo de plantas, coletadas em 21/01/98, caracterizando o período vegetativo e 10/07/98, período de dormência, (fator C). As amostras foram congeladas em freezer a -25ºC e processadas gradativamente.
A quantificação da atividade das peroxidases foi determinada de acordo com a técnica descrita por MATSUNO & URITANI (1972), padronizada no Laboratório, como segue: os extratos de todo material utilizado (casca e lenho), foram processados em temperatura inferior a 4oC; pesou-se 3g da casca e 3g do lenho individualizados, triturou-se em multi-processador por três minutos, com 100ml de solução tampão extratora de fosfato monobásico e dibásico de potássio, pH 7, sendo 40 ml do tampão congelado e 60ml líquido (abaixo de 4oC), com adição de Polivinilpirrolidona; o extrato foi filtrado a vácuo em papel filtro Whatman nº 1, sendo todo o filtrado coletado em vidrarias pré-resfriadas colocadas em bandejas com gelo durante a execução das atividades. Após a filtragem, os extratos foram colocados em frascos gelados e estocados em ultra-freezer para posterior análise. O descongelamento do material foi realizado, deixando-se de véspera, os extratos em geladeira (abaixo de 4oC), e o descongelamento final obtido em bandeja com gelo durante aproximadamente três horas, usando-se termômetro para acompanhar a temperatura; posteriormente centrifugou-se 35ml do extrato por 20min a 5000rpm em temperatura inferior a 4-176; C e o líquido sobrenadante foi transferido para outro recipiente e utilizado como extrato enzimático. Para o cálculo da atividade das peroxidases, as leituras foram realizadas após 10 minutos, em espectrofotômetro, modelo UV - 160 1PC Shimadzu, em comprimento de onda de 450 nm. Uma unidade de enzima corresponde a um aumento na absorbância de 0,001 unidade ótica/minuto. Na prova em branco, usaram-se reagentes e água destilada (em vez do extrato enzimático).
A quantificação dos compostos fenólicos totais foi realizada em duas fases. A primeira compreende o preparo do extrato e a extração dos fenóis totais - método adaptado de BIELESKI & TURNER (1966) - composto das etapas de pesagem da matéria fresca, adição da solução metanol, clorofórmio e água (MCA), na relação 6/2,5/1,5 v/v respectivamente, trituração em almofariz à temperatura ambiente, centrifugada a 6000g por 20min, e coletado o sobrenadante. Realizou-se nova extração do resíduo remanescente, adicionando-se mais 4ml de MCA agitando-se em vórtex, centrifugado novamente a 6000g por 20min e o sobrenadante sendo adicionado ao primeiro, obtendo assim o extrato MCA. Ao extrato MCA foi adicionado 1ml de clorofórmio e 1,5ml de água, procedendo-se nova centrifugação a 6000g por 15min para separação das fases.
A segunda fase compreende a determinação de fenóis totais realizada pelo método adaptado de JENNINGS (1981), nas seguintes etapas: (i) preparou-se uma curva padrão, utilizando-se quantidades conhecidas de tirosina (na faixa de 0 a 100 mg), e feita a curva de calibração a partir de uma solução com 100mg de tirosina/ml (5mg de tirosina/50ml de água); (ii) preparou-se as amostras para a leitura em espectrofotômetro, modelo UV - 160 1PC Shimadzu, em comprimento de onda de 760nm. A amostra foi preparada a partir da retirada de uma alíquota de 0,5m>l da parte superior do tubo de extrações dos fenóis (extrato MCA), a seguir adicionado 0,5ml de água destilada, mais 0,5ml do reagente Folin-Ciocalteau misturando-se em vórtex. Após 15min, foi adicionado 5ml do reagente alcalino "A" (preparado com carbonato de sódio 2% em uma solução de hidróxido de sódio 0,1N), e a solução agitada em vórtex. Após 50min foi feita a leitura da absorbância em 760nm em cubetas de 1cm. Na prova em branco, usou-se água. O resultado foi expresso em mg/g de tecido - peso fresco.
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, com três fatores e quatro repetições. Fator (A): seis porta-enxertos; fator (B): casca e lenho; fator (C): período de crescimento e dormência. A comparação entre as médias dos tratamentos foi realizada pelo teste de Duncan em nível de 5 % de probabilidade de uso, com o auxílio do programa SANEST (ZONTA et al, 1991).
Verificaram-se efeitos significativos dos fatores porta-enxertos, tipos de tecidos (casca e lenho), período de crescimento, dormência nos porta-enxertos e da interação entre os mesmos, o que possibilitou estudos comparativos da atividade da peroxidase e dos fenóis totais na casca e no lenho dos porta-enxertos (Tabelas 1 e 2).
Maior atividade das peroxidases na casca dos porta-enxertos foi observado no período de dormência, diferindo do período de crescimento (Tabela 1). Estes resultados estão de acordo com CITADIN (1999), que observou um aumento na atividade das peroxidases em ramos de 7 cultivares de pessegueiro durante o inverno e um decréscimo na atividade da mesma, após a saída de dormência. Desta forma, tem-se procurado relacionar o ponto de máxima atividade das peroxidases com a saída da dormência, em condições de inverno subtropical.
No lenho, tanto no período de crescimento vegetativo como no de dormência, não houve variação entre os porta-enxertos na atividade das peroxidases, que foi baixa (Tabela 1). Comparando-se a atividade das peroxidases entre os tipos de tecidos, observou-se que a casca apresenta maior atividade que o lenho, tanto no período de crescimento vegetativo, como na dormência (Tabela 2). Baseado nestas observações, constatou-se uma maior atividade enzimática presente na casca, por ser uma região de grande atividade meristemática. Esses resultados demonstram ser a zona cambial uma região de maior metabolismo das plantas que facilita a lignificação dos novos tecidos que surgem ou a soldadura da gema no ponto de enxertia.
As maiores atividades das peroxidades são observadas nas paredes celulares e a parede primária representa a matriz na qual ocorre a lignificação, catalisada pela enzima. A atividade também está envolvida no metabolismo de compostos fenólicos atuando no processo de regulação da formação de raízes (SIEGEL, 1993). No presente trabalho, explica-se a maior concentração enzimática, no período de dormência, pela maior lignificação dos tecidos nesta época. Sabe-se que esta enzima atua na biossíntese da lignina.
Diversos autores (GASPAR et al., 1982; DONALD & CIPOLLINI, 1998), comentam que as mudanças nas condições ambientais, o ataque de agentes infecciosos (vírus, bactérias e fungos) e injúrias mecânicas induzem e/ou modificam a atividade das peroxidases, as quais, têm este comportamento, como forma de aumentar a capacidade de defesa da planta. Segundo SIEGEL (1993), em condições de estresse, as plantas apresentam alta atividade das peroxidases e freqüentemente, estas são as primeiras enzimas a alterarem a atividade depois da estimulação. Entretanto, pouco se conhece sobre o papel destas no crescimento, desenvolvimento e respostas ao estresse e ao meio ambiente (LAGRIMINI et al., 1990).
KURODA & SAGISAKA (1998) demonstraram que as catalases e as peroxidases aumentam abruptamente durante os primeiros estágios de aclimatização ao frio. Estes autores sugerem que a catalase está envolvida na remoção de H2O2, que é produzido durante as reações de síntese de proteínas, organelas e ATP, enquanto as peroxidases contribuem para a formação de H2O2 requerida para a lignificação da parede celular. Já CITADIN (1999) sugere que esta enzima está relacionada, também, com a destruição da auxina natural, condição essencial para reduzir a atividade celular e de crescimento da planta.
Com relação aos porta-enxertos, observou-se que o Mirabolano apresentou os maiores valores de atividade das peroxidases, diferindo dos demais (Tabela 1), podendo desta forma representar um fator fisiológico e bioquímico de incompatibilidade quando enxertado com cultivares de menor atividade das peroxidases. Estes resultados confirmam aqueles obtidos na prática da enxertia, ou seja, sempre que for enxertado pessegueiro sobre mirabolano, existem sintomas claros de incompatibilidade. Isto confirma as citações de SIMÃO (1998) e SOUTHWICK & WEIS (1998) que mencionam a incompatibilidade existente nos enxertos de pessegueiro sobre o porta-enxerto Mirabolano.
Estudos de SANTAMOUR (1992) concluíram que as diferenças na concentração das peroxidases entre o porta-enxerto e o enxerto podem levar a uma lignificação anormal e a uma carência de conexões vasculares na zona do enxerto. Isto sugere que as peroxidases possuem um papel específico na lignificação, porém as generalizações sobre sua função na incompatibilidade devem ser propostas com cautela.
Nos fenóis totais da casca, observou-se o comportamento contrário aquele das peroxidases, quanto aos períodos de crescimento, obtendo-se valores altos no período de crescimento vegetativo e menores no período de dormência, para todos os porta-enxertos. No lenho, entre os períodos de crescimento e entre os porta-enxertos, verificou-se valores baixos e similares entre si (Tabela 1).
Entre a casca e o lenho, os fenóis totais foram maiores na casca para todos porta-enxertos, tanto no período de crescimento quanto na dormência (Tabela 2).
Essa alternância entre fenóis e peroxidases, períodos de crescimento vegetativo e dormência é perfeitamente explicada pela reação enzimática que ocorre entre esses dois compostos. Segundo FRY (1986), as peroxidases utilizam os fenóis, principalmente aqueles de baixo peso molecular, como substrato para síntese de peroxidases, apresentando sempre um balanço inversamente proporcional. Desse modo, sugere-se que tais compostos estão interrelacionados, podendo ser importantes fatores fisiológicos e bioquímicos da compatibilidade da enxertia.
A lignificação da parede celular na planta é formada por polímeros de lignina, os quais contêm compostos fenólicos, nos quais seus radicais são oxidados pelas peroxidases. Este fenômeno, geralmente, ocorre em resposta ao estresse (SIEGEL, 1993), pois atua como um mecanismo de defesa, podendo ser produzido precocemente e evita a penetração de patógenos e/ou, quando já está ocorrendo o ataque, intensifica a formação da peroxidase. Neste evento, encontra-se envolvida principalmente as peroxidases ácidas e parece estar co-relacionada com o decréscimo dos níveis endógenos de auxinas (GASPAR et al., 1982).
A atividade das peroxidases e a concentração de fenóis totais variam entre os porta-enxertos, período de crescimento e do tipo de tecido do caule. Maior atividade das peroxidases e concentrações de fenóis totais ocorreram nos porta-enxertos Mirabolano e Marianna. A atividade das peroxidases e fenóis totais foi maior na casca do que no lenho. No período de dormência, ocorreu maior atividade das peroxidases e menores quantidade de fenóis totais, sendo o inverso no período vegetativo.
BIELESKI, R.L., TURNER, N.A. Separation and estimation of amino acids in crude plant extracts by Thin-Layer electrophoresis and chromatography. Analytical Biochemistry, Nova York, v.17, p.278-293, 1966.
[ Medline ]
CITADIN, I. Necessidade de calor para antese e brotação em pessegueiro Prunus persica L. Batsch. Pelotas, 1999. 74p. Dissertação (Mestrado em agronomia) - Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, Universidade Federal de Pelotas, 1999.
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Alexandre Couto Rodrigues1 Ângela Campos Diniz2 José Carlos Fachinello2 João Baptista da Silva2 João Luiz Carvalho Faria2
angela[arroba]cpact.embrapa.br
1. Engenheiro Agrônomo, Doutor, Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, Universidade Federal de Pelotas.
2. Engenheiro Agrônomo, Mestre, Embrapa Clima Temperado, CP 403, 96001-970, Pelotas/RS.
Artigo original: Cienc. Rural. 2002, vol. 32, no. 4, pp. 559-564.
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