 Página anterior | Voltar ao início do trabalho | Página seguinte  |
Material vegetal
Foram utilizadas maçãs (Malus domestica Borkh), cv. Jonagold, colhidas em pomares comerciais da empresa RASIP-SA, em Vacaria-RS, safras 95/96 e 96/97. A colheita das frutas foi realizada em dois estádios de maturação: 1) verde-imaturo e 2) verde-maduro ou pré-climatérico. As frutas verde-imaturas foram avaliadas na colheita e 120 horas após. Já as maçãs colhidas no estádio pré-climatérico foram pré-resfriadas e armazenadas em AN a 0° C e 95% de umidade relativa (UR), e em AC a 0° C, 95% UR, 1,5% O2 e 2,5% de CO2, durante 4 meses.
Análises físicas, químicas e imunoquímicas
Na instalação do experimento, aos 90 dias e aos 120 dias de armazenamento, coletaram-se 3 amostras de 10 frutas cada para a determinação da firmeza da polpa, sólidos solúveis totais (SST), acidez total titulável (ATT), produção de etileno e atividade ACC oxidase. Estas análises foram efetuadas 24 horas e 120 horas após a retirada das frutas das câmaras frias. Também, realizou-se "western blot" para monitorar a síntese da ACC oxidase e suas isoformas.
A firmeza de polpa foi determinada com o auxílio de um penetrômetro manual, com ponteira de 11mm, e os resultados foram expressos em Newton (N).
Os sólidos solúveis totais foram determinados através de refratômetro e os resultados foram expressos em ºBrix.
A acidez total titulável foi realizada por titulometria de neutralização e os resultados foram expressos em meq. de NaOH.100mL de suco-1.
A produção de etileno foi determinada por cromatrografia gasosa e os resultados foram expressos em nL de etileno.h-1.g-1. Neste caso, as amostras de aproximadamente 1,5 Kg, foram incubadas em frascos de 5L, hermeticamente fechados, durante 1 hora. Passado este período, foi coletado 1mL da atmosfera gasosa para a dosagem de etileno.
A atividade ACC oxidase in vitro foi determinada baseando-se nas condições preconizadas por DUPPILE et al. [12]. Para cada ensaio, 1g de maçã foi congelado em nitrogênio líquido, desintegrado mecanicamente e homogeneizado em 2mL de tampão Tris-HCl 100mM, pH 7,4, contendo 10% (v/v) de glicerol, 30mM de ascorbato de sódio, 1% (m/v) de polivinilpirrolidona e 5mM de ditiotritol. O material foi mantido sob agitação durante 30 minutos a 4° C e, em seguida, centrifugado a 45.000g durante 30 minutos. O sobrenadante foi submetido a uma dessalinização em coluna P-D10 previamente equilibrada com Tris-HCl 100mM, pH 7,4. O eluído, doravante denominado extrato solúvel, foi utilizado para a determinação da atividade ACC oxidase. A dosagem propriamente dita, foi realizada avaliando a produção de etileno obtida após 30 minutos de incubação, a 26° C, do extrato solúvel, acrescido de 250mM de ACC, ou de 250mM de ACC e 10mM de sulfato ferroso, ou de 250mM de ACC, 10mM de sulfato ferroso e 30 mM ascorbato de Na. Como controle foi utilizado extrato protéico solúvel sem adição do substrato e dos cofatores.
Para a avaliação da síntese da ACC oxidase e a presença de isoformas, utilizou-se a técnica de "western blot", que compreende as etapas de extração, separação eletroforética, eletrotransferência e imunodetecção.
A extração das proteínas para SDS-PAGE (sodium dodecil sulphate – polyacrilamide gel electrophoresis) seguiu as recomendações descritas por MEYER et al. [22]. Para a isoeletrofocalização adaptou-se a metodologia de LELIÈVRE et al. [20], de maneira que as proteínas foram dissolvidas em uma solução contendo 9M de uréia, 5 % (v/v) de b-mercaptoetanol, 2 % (v/v) de Nonidet P-40 e 5 % (v/v) de anfolinas (pI 3,0-10,0) e depositadas na extremidade do gel correspondente ao ânodo. As soluções nas câmaras correspondentes ao cátodo e ao ânodo foram, respectivamente, H3PO4 25mM e NaOH 50mM. A isoeletrofocalização foi realizada aplicando-se, progressivamente, 150V durante os primeiros 30 minutos e 200V por 150 minutos. Em seguida, o gel de isoeletrofocalização foi incubado durante 20 minutos em tampão LAEMMLI [18], como etapa preparatória para a SDS-PAGE.
Para a determinação do gradiente de pH, as pistas foram fracionadas em pedaços de 0,5cm de comprimento, e incubadas durante 1 hora em 1mL de KCl 10 mM. A massa molecular dos diferentes polipeptídeos foi determinada utilizando-se marcadores de um kit da Bio Rad.
A eletrotransferência das proteínas para membranas de nitrocelulose (Bio Rad) 45m m foi realizada durante 1 hora a 130 V, num tampão Tris 25mM – Glicina 192mM, pH 8,3, contendo 20% (v/v) de metanol. A imunodetecção foi realizada seguindo as recomendações de ROMBALDI et al. [22] adaptadas para maçã por CHAVES et al. [8].
Delineamento experimental
O experimento foi realizado segundo um delineamento experimental inteiramente casualizado, segundo um esquema fatorial 3 x 3 x 2 (sistemas de armazenamento x período de armazenamento x período para a análise pós-armazenamento), com 3 repetições de 10 frutas cada.
Expressão da ACC oxidase e produção de etileno
Em maçãs verde-imaturas não foi detectada a presença da ACC oxidase (Figura 1-1), mesmo quando essas maçãs foram mantidas em condições ambientais não controladas durante 120 horas (Figura 1-2). Nessas mesmas condições, a produção de etileno foi muito baixa, nunca ultrapassando 0,5 nL.g-1.h-1 (Tabela 1), citado como nível máximo para materiais classificados como fracamente produtores de etileno [1].
Em maçãs colhidas no estádio pré-climatérico também não foi detectada ACC oxidase (Figura 1-3). Porém, quando elas foram mantidas durante 120 horas em condições ambientais, houve síntese e acúmulo da proteína (Figura 1-4). Nesse mesmo período observou-se um aumento na produção de etileno de 4 para 13nL.g-1.h-1 (Tabela 1). Isso se deve, provavelmente, ao fato de a operação de colheita constituir-se em um estresse indutor e ao sistema autocatalítico de produção de etileno já estar ativo [8, 29].
Em maçãs colhidas no estádio pré-climatérico e armazenadas durante 90 dias em AN (Figura 1-5), a ACC oxidase estava presente. A manutenção dessas frutas durante 120 horas em condições ambientais, induziu a síntese da ACC oxidase, evidenciada pela maior intensidade da reação imunoquímica (Figura 1-6). Correlacionado a essa variação, houve um incremento na produção de etileno passando de 28 para 37nL.g-1.h-1 (Tabela 1). Esse comportamento indica que somente a refrigeração não é suficiente para controlar a síntese da ACC oxidase, nem para reduzir a produção de etileno. Além disso, as baixas temperaturas mostraram-se como agente indutor da síntese dessa enzima quando as frutas foram retiradas da câmara fria.
LELIÈVRE et al. [20] observaram que as baixas temperaturas (0 a 4° C) durante o armazenamento de pêras, cv. Passe Crassane, estimulam a produção autocatalítica do etileno, agindo como sinal indutor dos genes das enzimas ACC sintase e ACC oxidase. Além disso, eles demonstraram que as frutas dessa cultivar necessitam de um período de, no mínimo, 12 semanas de estocagem a baixas temperaturas para que o processo de maturação ocorra normalmente. Entretanto, citam que, dependendo da espécie e do cultivar, bem como do período de estocagem, o efeito das baixas temperaturas pode ser variado, agindo às vezes como agente indutor, às vezes como inibidor ou às vezes sem nenhuma interferência no processo de maturação/senescência.
Quando estendeu-se o período de frigoconservação para 120 dias em AN (Figura 1-9), houve um importante acúmulo de ACC oxidase. A manutenção das maçãs durante 120 horas em condições ambientais não controladas (Figura 1-10) acentuou esse fenômeno, sem, no entanto, ter-se observado um marcante aumento na produção de etileno (Tabela 1). Nessa fase, as frutas apresentavam características de senescência avançada.
O uso de AC foi mais eficiente no controle da síntese da ACC oxidase (Figura 1-7 e 1-11) do que a AN (Figura 1-5 e 1-9). Segundo KADER, ZAGORY & KERBEL [14], a redução da concentração de O2 e o aumento da concentração de CO2, nas condições de AC, proporcionam uma redução da taxa respiratória, da atividade clorofilase, da síntese de carotenos e de compostos antociânicos e da produção e da ação do etileno. DUPILLE et al. [12] demonstraram que a baixa produção de etileno em maçãs, cv. Golden Delicius, armazenadas em AC, não é devida à deficiência de ACC nas células vegetais. Os resultados apresentados (Figura 1) demonstram que esse comportamento está relacionado com a inibição da síntese da ACC oxidase, já que nenhuma quantidade dessa proteína foi detectada em maçãs frigoconservadas em atmosfera controlada durante 90 (Figura 1-7) e 120 dias (Figura 1-11).
A manutenção das maçãs em condições ambientais não controladas por 120 horas, após 90 dias (Figura 1-8) e 120 dias (Figura 1-12) de armazenamento em AC, induziu a síntese da ACC oxidase. Como conseqüência, a produção de etileno também aumentou, passando de 10 para 86,5nL.g-1.h-1 em frutas estocadas durante 90 dias em atmosfera controlada e de 13 para 90nL.g-1.h-1 (Tabela 1) naquelas frutas armazenadas durante 120 dias nas mesmas condições.
Parâmetros de qualidade
O estudo das características físico-químicas das frutas mostrou que as maiores variações da firmeza de polpa, da ATT e dos SST foram detectadas em maçãs armazenadas em AN (Tabela 1). Aos 90 dias de estocagem em AN, as maçãs apresentavam valores de firmeza de polpa limitantes para o consumo in natura. Isso se agravou quando as maçãs foram retiradas da câmara fria e mantidas em condições ambientais por 120 horas. Além disso, as frutas apresentavam-se num estádio de senescência avançado, caracterizado pelo declínio da produção de etileno. Embora trabalhando com outra cultivar, BRACKMAN & SAQUET [5] e BRACKMAN, ARGENTA & MAZARO [6] também observaram comportamento similar.
Tendência semelhante foi observada em maçãs armazenadas em AC, embora esse sistema tenha proporcionado uma melhor preservação da firmeza da polpa, da ATT e dos SST das maçãs. A remoção destas frutas da câmara de estocagem resultou num importante incremento na produção de etileno. Essas alterações estão associadas à aceleração do processo de maturação/senescência, estimulado pelo aumento da temperatura e da concentração de O2 e pela diminuição da concentração de CO2. O etileno é citado como o principal responsável pela aceleração do metabolismo de materiais climatéricos [24] e o incremento na sua produção como a causa indutora dessas alterações [14]. Do ponto de vista metabólico, o aumento da síntese desse fitoregulador, tanto em frutos armazenados em AN quanto em AC, indica que houve preservação da integridade biológica das células [7, 20]. Do ponto de vista tecnológico, isso implica na utilização de meios para controlar a produção e/ou a ação do etileno após a remoção do material das câmaras de estocagem.
Propriedades bioquímicas da ACC oxidase
A análise dos resultados apresentados na Figura 2 mostra que a adição de 250m M de ACC ao extrato solúvel aproximadamente quadruplicou a atividade ACC oxidase, passando de 30 (± 3) para 140 (± 7) nL.mg-1.h-1, indicando que a produção de etileno nessas frutas ainda é limitada pela concentração de substrato. A suplementação do meio com os cofatores sulfato de ferro na concentração de 10 mM e de ascorbato de sódio na concentração de 30 mM permitiu um aumento na atividade ACC oxidase de 140 (± 7) para 260 (± 5) nL.mg-1.h-1 e de 260 (± 5) para 300 (± 4) nL.mg-1.h1, respectivamente. DONG, FERNANDEZ-MACULET & YANG [10], DUPILLE et al. [11], JOHN & DOPNING [13] e VERVERIDES & JOHN [31] também demonstraram que esses cofatores aumentam a atividade ACC oxidase.
JOHN & DOPNING [13] citam que na reação de oxidação do ACC em etileno há formação de radicais peróxidos, potenciais catalisadores de reação de proteólise, podendo gerar peptídeos de menor peso molecular. A detecção de bandas protéicas de menor peso molecular também já havia sido relatada por KUAI & DILLEY [17]. No entanto isto não foi verificado nos extratos protéicos de maçãs Jonagold analisados (Figura 2A, pistas 1 a 4) onde, em todos os tratamentos, foi detectada uma única banda protéica, de peso molecular em torno de 37 kDa.
Entretanto, a adição de substrato e de cofatores afetou o pI desta proteína (Figura 2B). A adição de ACC ao extrato solúvel (Figura 2B, pista 2) proporcionou o surgimento de uma segunda banda protéica, de pI 5,87. Com a adição de Fe+2 ou ascorbato de sódio (Figura 2B, pistas 3 e 4, respectivamente), detectou-se uma terceira banda protéica de pI 5,78.
O estudo da estrutura primária das proteínas dos genes da ACC oxidase de tomate [4] e de melão [19] indica a existência de três isoformas, resultantes da expressão diferencial dos genes.
Já os estudos realizados com a ACC oxidase de maçã, cv. Jonagold, indicam que há uma única proteína de 37kDa e de pI5,95. O surgimento de isoformas de pI5,87 e 5,78 se deve à presença do substrato (ACC) e dos cofatores. CHOU & FASMAN [9] citam que alterações das regiões expostas das proteínas, provocadas pela interação com substrato e cofatores, podem alterar o balanço de cargas, gerando moléculas com pI distintos. Portanto, neste caso, a presença de isoformas não se deve à expressão de diferentes genes da ACC oxidase.
[1] ABELES, F. B., MORGAN, P. W. & SALTVEIT, M. E. Jr. Ethylene in plant biology. 2. Ed. San Diego: San Diego Academic Press, 414p.,1992.
[2] AYUB, R., GUIS, M., AMOR, M. B., GILLOT, L., ROUSTAN, J. P., LACHÉ, A., BOUZAYEN, M. & PECH, J. C. Expression of ACC oxidase antisense gene inhibits ripening of cantaloupe melon fruits. Nature Biotechnology. v. 14, p. 862-866, 1996. [
Medline ][3] BALAGUÉ, C., WATSON, C. F., TORNER, A. J., ROUGÉ, R., PICTON, S., PECH, J. C. & GRIERSON, D. Isolation of a ripening and wound-induced cDNA from Cucumis melo L., with homology to gye ethylene-forming enzime. Eur. J. Biochem. V. 212, p. 27-34, 1993.
[4] BOUZAYEN, M., COOPER, W., BARRY, C., ZEGZOUTI, H., HAMILTON, A. J. & GRIERSON, D. EFE multi-gene family in tomato plants: expression and characterization. In: CELLULAR AND MOLECULAR ASPECTS OF THE PLANT HORMONE ETHYLENE. Pech, J.C., Latché, A. & Balagué, C. (eds). Kluwer Academic Publischers, Dordrecht, the Netherlands, p. 76-81, 1993.
[5] BRACKMAN, A. & SAQUET, A. A. Armazenamento de maçã cv. Gala em atmosfera controlada. Rev. Bras. de Agrociência, v. 1, n. 2, p. 55-60, 1995.
[6] BRACKMAN, A., ARGENTA, L. C. & MAZARO, S. M. Concentrações de O2 e CO2 na qualidade de maçãs (Malus doméstica Bork) cv. Gala, armazenadas a 0,5oC e 2,5oC. Rev. Bras. de Agrociência, v. 2, n. 1, p. 51-56, 1996.
[7] CHAMBROY, Y. & SOUTY, M. Rôle du CO2 sur le comportement des fruits à noyau utilisation des atmosphéres modifiées. In. ACTAS DEL SEMINARIO CELEBRADO EN LA FIRA DE LLEIDA, Lleida - España, Octobre, p. 139-169, 1994.
[8] CHAVES. A. L., BIERHALS, J. D., ZIMMER, P. D., SILVA, J. A. & ROMBALDI, C. V. Caracterização imunoquímica da ACC (ácido 1-aminocicloproano-1-carboxílico) oxidase em frutos climatéricos. Ciênc. Tecnol. de Aliment. v. 17, n. 3, p. 320-324, set-dez, 1997.
[9] CHOU, P. Y. & FASMAN, G. D. Prediction of protein comformation. Biochemistry, n. 13, p. 222-245, 1974.
[10] DONG, J. G., FERNANDEZ-MACULET, J. C. & YANG, S. F. Purification and characterization of 1-amino-cyclopropane-1-carboxylate oxidase from apple fruit. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, n. 89, p. 9789-9793, 1992.
[11] DUPILLE, E., LATCHÉ, A., ROQUES, C. & PECH, J.-C. Stabilisation in vitro et purification de l’enzime formant l’éthylene chez les pommes. C. R. Acad. Sci., n. 315, p. 77-84, 1992.
[12] DUPILLE, E., ROMBALDI, C. V., LELIÈVRE, J.-M., CLEYET-MAREL, J.-C., PECH, J.-C. & LATCHÉ, A. Purification, properties and partial amino-acid sequence of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase from apple fruits. Planta, n. 190, p. 65-70, 1993. [
Medline ][13] JOHN, P. & DOPNING, S. Recovery of active, highly purifical recombinant ACC oxidase. Phytochemestry. n. 36, p. 727-732, 1997.
[14] KADER, A. A., ZAGORY, D. & KERBEL, E. L. Modified atomosfere packaging of fruits and vegetables. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. Davis, California. 29p., 1989.
[15] KENDE H. Ethylene biosynthesis. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., n. 44, p. 283-307, 1993.
[16] KIEBER, J. J., ROTHENBERG, M., ROMAN, G., FELDMAN, K. A. & ECKER, J. R. CTR1, a negative regulator of the ethylene response pathway in Arabidopsis, encodes a member of the Raf family of protein kinase. Cell, n. 72, p. 427-441, 1993. [
Medline ][17] KUAI, J. & DILLEY, D. R. Extraction, partial purification, and characterization of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxydase from apple fruit. Posth. Biol. Tech., n. 1, p. 203-211, 1992.
[18] LAEMMLI, K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the bacteriophage T4. Nature, n. 277, p. 680-685, 1970.
[19] LASSERE, E., BOUQUIN, T., HERNANDEZ, J. A., BULL, J., PECH, J.-C. & BALAGUÉ, C. Structure and expression of three genes encoding ACC oxidase homologs from melon (Cucumis melo L.). Mol. Gen Genet. n. 251, p. 81-90, 1996.
[20] LELIÈVRE, J.-M., TICHIT, L., DAO, P., FILLION, L. NAM, U.-W, PECH, J.-C. & LATCHÉ, A. Effects of chiling on the expression of ethylene biosynthetic genes in Passe-Crassane pear Pyrus communis L. fruits. Plant Molecular Biology. n. 33, p. 847-855, 1997.
[21] MANSOUR, R., LATCHÉ, A., VAILLANT, V., PECH, J.-C. & REID, M. S. Metabolism of aminocyclopropane-1-carboxylic acid in ripening apple fruit. Plant Physiol., n. 66, p. 495-502, 1986.
[22] MEYER, Y., GROSSET, J., CHARTIER, Y. & CLEYET-MAREL J.C. Preparation by two-dimensional electrophoresis of proteins for antibody production: Antibodies against proteins whose synthesis is reduced by auxin in tobacco mesophyl protoplasts. Electrophoresis, n. 9, p. 704-712, 1988. [
Medline ][23] OELLER, P. W., MIN-WONG, L., TAYLOR, L. P., PIKE, D. A. & THEOLOGIS, A. Reversible inhibition of tomato fruit senescence by antisense RNA. Science, n. 254, p. 437-439, 1991. [
Medline ][24] PECH, J.-C., LASSERRE, E., AYUB, R., GUIS, M., BIDONDE, S., HERNANDEZ, J. A., RAMASSAMY, E., ROMBALDI, C., BOUZAYEN, M., BALAGUÉ, C. & LATCHÉ, A. Involvement of ethylene in fruit ripening. Expression and control of ACC oxidase gene. Austral J. Hort Res, 1995
[25] PECH, J.-C., RAYNAL, J. & LATCHÉ, A. Physiologie des fruits à noyau lors du développement et de la maturation sur l’arbre. In. ACTAS DEL SEMINARIO CELEBRADO EN LA FIRA DE LLEIDA, Lleida-España, Octobre, p. 17-35, 1994.
[26] PICTON, S., BARTON, S., BOUZAYEN, M., HAMILTON, A. & GRIERSON, D. Altered fruit ripening and leaf senescence in tomatoes expressing an antisense ethylene-forming enzyme transgene. Plant Journal, n. 3, p. 461-481, 1993.
[27] ROMBALDI, C. V., LELIÈVRE, J. M., LATCHÉ, A., PETITPREZ, K. Z., BOUZAYEN, M. & PECH, J.-C. Immunocytolocalization of ACC oxidase in tomato fruit. Planta, n. 192, p. 453-460, 1994. [
Medline ][28] SPANU, P., REINHARDT, D. & BOLLER, T. Analysis and cloning of the ethylene-forming enzyme from tomato by functional expression of its mRNA in Xenopus laevis oocytes. EMBO J., n. 10, p. 2007-2013, 1991. [
Medline ][29] STAKIOTAKIS, E. M. & DILLEY, D. Internal ethylene concentrations in apple ftuits attached to or detached from the tree. J. Amer. Soc. Hort. Sci., n. 98, p. 501-503, 1973.
[30] TANG, X., WANG, J., BRANDT, A. S. & WOODSON, W. R. Organization and structure of the 1-aminoxyclopropane-1carboxylate oxidase gene family from Petunia hybrida. Plant Mol. Biol., n. 23, p. 1151-1164, 1993.
[31] VERVERIDES, P. & JOHN, P. Complete recovery in vitro of ethylene forming enzyme activity. Phytochem., n. 30, p. 725-727, 1991.
[32] ZIMMER, P. D., SILVA, J. A., BIERHALS, J. D. & ROMBALDI, C. V. ACC (ácido 1-carboxílico-1-aminociclopropano) oxidase em maçãs armazenadas em atmosfera refrigerada e controlada. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS, 16. Anais... Rio de Janeiro, RJ. SBCTA, Rio de Janeiro, RJ, 1998. p. 1038-1040.
Agradecimentos
À Capes e ao CNPq pela concessão de bolsas, à FAPERGS e ao Pólo de Alimentos pelo suporte financeiro, à RASIP-SA pelo fornecimento do material vegetal e ao Laboratoire Éthylène et Maturation des Fruits do ENSAT de Toulouse/França, pelo auxílio técnico.
Paulo Dejalma ZIMMER2, Jaqueline Dettmann BIERHALS3, Jorge Adolfo SILVA2, Cesar Valmor ROMBALDI4 -
ctajorge[arroba]brturbo.com.br1
Abreviaturas: ACC: Ácido 1-carboxílico-1-aminociclopropano; AC: atmosfera controlada; AN: atmosfera normal; SDS-PAGE: sodium dodecil sulphate – polyacrilamide gel electrophoresis.2
Engo Agro, MSc., Doutorando no Centro de Biotecnologia/UFPEL3
Engo Agro MSc. em Ciência e Tecnologia Agroindustrial4
Professor Adjunto, Dr., DCTA/FAEM/UFPEL, CP 354. Laboratório de Biotecnologia de Frutas e Hortaliças - Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial. Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel - Universidade Federal de Pelotas.| Página anterior | Voltar ao início do trabalho | Página seguinte |
|
|
|
