Inibição da síntese da ACC (ácido 1-carboxílico-1-aminociclopropano) oxidase em maçãs frigoconservadas em atmosfera controlada

Foi estudada a expressão da ACC oxidase em maçãs, cv. Jonagold, colhidas no estádio pré-climatérico e armazenadas sob refrigeração em atmosfera normal (0^oC, 95% UR - AN) e controlada (0^oC, 95% UR, 1,5% O₂ e 2,5% CO₂ - AC), durante 180 dias. Na instalação do experimento, aos 90 e aos 120 dias, foram coletadas amostras para a determinação da firmeza de polpa, da acidez total titulável, dos sólidos solúveis totais, da produção de etileno, da atividade ACC oxidase e para a detecção imunoquímica das isoformas desta enzima. A dosagem da atividade ACC oxidase foi realizada por cromatografia gasosa a partir de extrato protéico solúvel acrescido de 250µM de ACC, 10µL de sulfato ferroso e 30µL de ascorbato de sódio. Para a detecção imunoquímica utilizou-se a técnica "western blot", com anticorpos policlonais anti-ACC oxidase de maçã, após separação das proteínas em eletroforese e isoeletrofocalização. Não foi detectada ACC oxidase em maçãs pré-climatéricas. Porém, após 120 horas em condições ambientais, houve a síntese dessa enzima e um incremento na produção de etileno. A refrigeração não exerceu controle na síntese da ACC oxidase e produção de etileno, resultando em significativas perdas físico-químicas nas frutas armazenadas em AN. Já a utilização de AC permitiu controlar a via de biossíntese do etileno, pela inibição da síntese da ACC oxidase, mantendo o material com boa qualidade para o consumo in natura. A adição de ACC e dos cofatores aumentou a atividade ACC oxidase e alterou o pI da ACC oxidase.

Palavras-chave: maturação, isoformas, frigoconservação.

Inhibition of (1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid) oxydase synthesis in apple fruits by controlled atmosphere storage. This experiment was carried out to evaluate the inhibition of the 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) oxidase in apple fruits by controled atmosphere. Jonagold apples were stored in normal atmosphere (NA) and controlled atmosphere (CA) storage. The fruits were harvested at the preclimateric stage and stored for 120 days at 0^oC and 95±5% RH with O₂ set to 1,5% and CO₂ set to 2,5% (CA) or without gas control (NA). At 90 and 120 days after harvesting, samples were collected to study the ethylene production by gas chromatography, ACC oxidase activity by gas chromatography and immunoblotting protein characterization by western blot, using specific polyclonal antibodies against ACC oxidase from apple fruit. Nevertheless, ACC oxidase was detected and the ethylene production was increased for those fruits stored by 120 hours under room temperature. Apples stored in NA did not control the ethylene production and ACC oxidase synthesis. However, apples stored in CA had the ethylene biosynthesis controlled and showed an ACC oxidase synthesis inhibited. In climacteric apples, the ACC oxidase activity increased by ACC, Fe⁺² and ascorbat addition in the enzymatic extract. Protein analysis by isoelectricfocusing showed three proteins with pIs 5.95, 5.87 and 5.78. Those with smallers pIs were detected in the presence of substrate and cofactors.

Keywords: ripening, isoforms, apple storage.

O processo de deterioração de frutas é variado e tem, de maneira geral, como causas principais, o próprio processo de senescência, as injúrias físicas e mecânicas, os danos causados por microorganismos e por outros seres, as alterações puramente químicas e os distúrbios fisiológicos [1, 15, 25].

A velocidade e a intensidade com que estas alterações ocorrem são dependentes das características genotípicas [7, 14], das condições edafoclimáticas e de cultivo [14], da colheita e do armazenamento [5, 6].

As ações implementadas visando prolongar o período de conservação das frutas in natura estão baseadas na redução da atividade metabólica do produto e de organismos associados.

Para a conservação de maçãs, a refrigeração, em atmosfera convencional ou normal (AN) e em atmosfera controlada (AC), tem sido o método mais empregado [5, 6, 7, 14].

Estudos recentes [5, 6] têm mostrado que, em AN, o período de conservação de maçãs das principais cultivares plantadas no Rio Grande do Sul e Santa Catarina é de 4-5 meses e preconizam o uso da AC para prolongar este período.

A AC permite, pela redução da concentração de O₂ e aumento da concentração de CO₂, reduzir a atividade respiratória, o crescimento de fungos e os distúrbios fisiológicos [5]. Além disso, ela permite reduzir significativamente a produção e a ação do etileno [7, 14, 25]. Este fitoregulador desempenha papel fundamental na regulação do processo deteriorativo intrínseco [16]. Sua via de biossíntese compreende a conversão da S-adenosil-metionina (SAM) em ácido 1-carboxílico-1-aminociclopropano (ACC) sob a ação da ACC sintase, e a conversão do ACC em etileno, CO₂ e HCN (ácido cianídrico), pela ACC oxidase. O ACC, precursor imediato do etileno, pode ser malonilado, sob a ação da enzima N-malonil transferase (NMT), e ser então transportado para os vacúolos [1, 15, 24].

As duas enzimas-chave na via de biossíntese do etileno são a ACC sintase e a ACC oxidase [8, 15]. A primeira foi isolada, purificada, seqüenciada e vários clones e genes foram caracterizados em várias espécies vegetais [1, 15]. A ACC oxidase só foi purificada em 1992 [10, 11], graças às descobertas de VERVERIDES & JOHN [31] que verificaram que esta enzima era dependente de ferro, ascorbato e CO₂. A partir daí, várias enzimas e cDNAs, incluindo as do tomate [4, 26, 28], do melão [2, 3, 19], da maçã [11, 12, 13, 17, 21], da pêra [20] e de flores [30] foram isoladas.

A descrição destes clones possibilitou o estudo da regulação de genes da enzima. BOUZAYEN et al. [4] isolaram e caracterizaram a família gênica da ACC oxidase em tomate. Estes autores isolaram três genes denominados efe1, efe2, e efe3, apresentando homologia de seqüência de 85%. A análise da seqüência primária das proteínas destes genes permitiu calcular os respectivos pontos isoelétricos (pIs): efe1 (4,99), efe2 (6,14) e efe3 (5,09). A partir daí, TANG et al. [30], caracterizaram três genes da ACC oxidase em flores de petúnia (ph-aco1, ph-aco2 e ph-aco3) sem, no entanto, calcularem os respectivos pIs. LASSERE et al. [19] realizaram o mesmo trabalho em melão e isolaram os genes cm-aco1 (pI 4,97), cm-aco2 (pI 5,59) e cm-aco3 (pI 4,97).

O estudo da expressão diferencial destes genes mostrou que apenas um deles é responsável pela maturação de tomates e de melão, respectivamente, efe1 e cm-aco1. PICTON et al. [26] verificaram que em tomates verde-imaturos e verde-maduros não havia presença de mRNA correspondentes ao efe1. Entretanto, nestes estádios de maturação foi detectada uma proteína ACC oxidase com atividade in vivo [8, 28] e in vitro [27]. As causas desta contorvérsia não foram demonstradas.

O controle da produção de etileno pode ser obtido através da atenuação da síntese e/ou da atividade das enzimas SAM, ACCS e/ou ACCO ou indução da enzima NMT [15].

As frutas mantidas sob refrigeração têm baixa produção de etileno, mas aceleram o metabolismo deste fitoregulador logo que são removidas das câmaras frias. Em conseqüência, observam-se intensas reduções de firmeza de polpa e aumento da atividade respiratória [32].

Nesse contexto, o trabalho teve por objetivo estudar o efeito da atmosfera controlada na síntese, atividade e expressão de isoformas da ACC oxidase em maçãs da cv. Jonagold.