Infecção e enfermidade neurológica pelo herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-5) (página 2)

Foram utilizados coelhos da raça Nova Zelândia, independente de sexo, obtidos no Biotério Central e no Colégio Agrícola da Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS. Para a inoculação, foram utilizadas três categorias de animais: coelhos recém-desmamados (30 a 35 dias), com três a quatro meses; e com aproximadamente 6 a 8 meses de idade. Os dados referentes às amostras e títulos virais utilizados e vias de inoculação estão apresentadas no Quadro 1. Os animais foram inoculados com 1ml da suspensão viral pela via intranasal, através de trepanação dos seios paranasais conforme metodologia modificada a partir de técnica descrita por Brown & Field (1990) e descrita com detalhes por Silva et al. (1999). Para a inoculação intranasal, os animais foram previamente anestesiados com Zoletil (Virbac, 100-200ul/animal). Dois grupos de 8 e 10 coelhos, respectivamete, foram inoculados pela via intraconjuntival, através da instilação de 1ml (0,5ml em cada lado) de suspensão viral no saco conjuntival (Quadro 1). Após a inoculação, os animais foram monitorados clinicamente; secções do encéfalo colhidas na necropsia foram submetidas à pesquisa de vírus e exames histológicos.

Coelhos recém-desmamados (30 a 35 dias de idade) foram inoculados com o BHV-5 (amostra EVI-88, 1ml contendo entre 10^7,51 e 10^7,64 DICC₅₀ ) pela via intranasal e sacrificados a intervalos de 24 horas após a inoculação. Suabes nasais e secções de diferentes áreas do SNC foram submetidas à pesquisa de vírus. As secções do encéfalo foram maceradas, homogeneizadas e resuspendidas em MEM (10% peso/volume). Após centrifugação a 2.500 rpm por 10 min, o líquido sobrenadante foi coletado e inoculado em células MDBK. As células foram monitoradas diariamente para o aparecimento de efeito citopático (ECP) e foram consideradas negativas após duas passagens de cinco dias cada sem o aparecimento de ECP.

Dois experimentos foram realizados para investigar a importância da rota olfatória no trânsito do BHV-5 da cavidade nasal até o SNC. No primeiro experimento, coelhos com idade de 3 a 4 meses e 6 a 8 meses foram inoculados com duas amostras do BHV-5, pelas vias intranasal e intraconjuntival, respectivamente (Quadro 1). O curso clínico e os índices de morbidade e mortalidade foram comparados com os índices observados após inoculação intranasal. O encéfalo dos animais que morreram ou foram sacrificados in extremis foram submetidos à pesquisa de vírus. No segundo experimento, doze coelhos foram submetidos à ablação cirúrgica do bulbo olfatório e posteriormente inoculados com o BHV-5 pela via intranasal. Para a cirurgia, os animais foram anestesiados com Fentanil (Citrato de Fentanila, Cristália, São Paulo, SP). A ablação do bulbo olfatório foi realizada através de trepanação seguida de aspiração e curetagem dos seios que abrigam o tecido olfatório. A completa remoção do bulbo olfatório foi confirmada por ocasião da necropsia. Esses animais foram inoculados com o BHV-5 (amostra EVI-88, dose 10^7,74DICC₅₀/ml) pela via intranasal, juntamente com o grupo controle, cinco dias após a cirurgia. O curso clínico da infecção e os índices de morbidade e mortalidade foram comparados. Secções do SNC dos coelhos que morreram ou foram sacrificados in extremis foram submetidos à pesquisa de vírus.

Nos experimentos realizados com a finalidade avaliar os efeitos da imunização ativa na infecção e enfermidade neurológica, foram utilizados 28 coelhos com 15 dias de idade. Dez coelhos foram imunizados através da inoculação subcutânea de 1ml de suspensão viral do BHV-5 (EVI-88, 10^6,81DICC₅₀/ml) e dez foram imunizados com o BHV-1 (amostra Cooper, 1ml contendo 10^7,64DICC₅₀/ml). Oito coelhos da mesma idade foram inoculados com MEM pela via subcutânea e serviram como controles não-imunizados. Vinte dias após a imunização, os 28 coelhos foram desafiados através de inoculação intranasal do BHV-5 (EVI-88, 1ml com 10^7,64DICC₅₀/ml) e monitorados clinicamente. Amostras de soro colhidas no dia da imunização e no dia do desafio foram testadas para anticorpos através da técnica de soro-neutralização (SN). Os testes de SN foram realizados em placas de poliestireno de 96 cavidades, utilizando-se diluições 1:2 crescentes de soro (inativado a 56ºC - 30 min) frente a doses constantes de vírus (100 DICC₅₀ /cavidade, amostra EVI-88). A leitura final foi realizada após 96 horas de incubação.

A pesquisa de vírus na cavidade nasal e em diferentes secções do SNC de coelhos sacrificados às 24h pós-inoculação detectou replicação viral somente na cavidade nasal. Em coelhos examinados a intervalos maiores após a inoculação, a replicação viral foi inicialmente detectada no bulbo olfatório (48h) e córtex olfatório (48/72h). As 72h o vírus foi detectado também no gânglio trigêmeo e ponte, além do córtex cerebral. No quarto dia após a inoculação, a infecção já encontrava-se distribuida em várias áreas do SNC (Quadro 2). Esses resultados demonstraram que após inoculação intranasal, o vírus atinge inicialmente o bulbo olfatório e sugerem que a invasão do SNC a partir da cavidade nasal ocorre inicialmente pela via olfatória. A detecção de vírus no bulbo olfatório já às 48h pi e a ampla distribuição do vírus no SNC a partir das 72/96h pós-inoculação indicam que a invasão e disseminação do BHV-5 no encéfalo de coelhos é muito rápida e eficiente.

A importância e participação da rota olfatória no acesso do BHV-5 ao encéfalo de coelhos foi investigada através de dois experimentos. No primeiro, coelhos foram inoculados pela via conjuntival com as mesmas amostras do BHV-5 que produziram infecção neurológica após inoculação intranasal. Quatro entre 10 (40%) dos coelhos inoculados com a amostra 613 e 1/10 (10%) dos coelhos inoculados com a amostra EVI-88 apresentaram sinais neurológicos e morreram. Além da morbidade menor, o curso clínico da doença neurológica nesses animais foi mais tardio do que nos animais inoculados pela via intranasal (Quadro 1). No segundo experimento, doze coelhos foram submetidos à ablação cirúrgica do bulbo olfatório e posteriormente inoculados com o BHV-5. Doze coelhos não submetidos à cirurgia foram utilizados como controle. Onze dos 12 animais (91,6%) controles desenvolveram a enfermidade, contra quatro de 12 (33,3%) dos coelhos submetidos à ablação do bulbo olfatório (Quadro 3). Os resultados desses dois experimentos indicam que o sistema olfatório não constitui-se na única via de acesso do BHV-5 ao SNC de coelhos. A interrupção cirúrgica dessa via reduziu drasticamente, mas não preveniu a invasão do SNC pelo BHV-5 a partir da cavidade nasal. Da mesma forma, a inoculação conjuntival, que provavelmente resulta em invasão do SNC por outra via nervosa, também pode resultar em invasão e infecção do SNC, porém com menor eficiência e mais tardiamente.

Para investigar se a imunização ativa com o vírus homólogo (BHV-5) e com um vírus heterólogo (BHV-1) protegeria coelhos da infecção e enfermidade neurológica, coelhos foram imunizados com o BHV-5 (EVI-88) ou com o BHV-1 (Cooper) e 20 dias após foram desafiados com o BHV-5. No dia do desafio, os coelhos imunizados com o BHV-1 apresentaram títulos de anticorpos neutralizantes superiores aos animais imunizados com o BHV-5 (Quadro 4). Os coelhos imunizados com o BHV-1 ficaram protegidos da doença clínica (apenas dois animais apresentaram sinais clínicos neurológicos passageiros) e da mortalidade. Coelhos imunizados com o BHV-5 também ficaram protegidos, porém com menor eficiência. Apenas um animal desenvolveu doença neurológica fatal e outros cinco apresentaram sinais clínicos passageiros e recuperaram-se (Quadro 4). Esses resultados indicam que além da proteção por imunização com o vírus homólogo, proteção contra a infecção e enfermidade neurológica pelo BHV-5 em coelhos pode ser obtida por imunização com o BHV-1.

Os resultados desse trabalho demonstram que a infecção e enfermidade neurológica pelo BHV-5 em coelhos, caracterizada por Silva et al. (1999), pode ser utilizada para estudar-se vários aspectos da infecção neurológica pelo BHV-5. Ressalvadas as diferenças que certamente existem nas relações entre o BHV-5 com bovinos e coelhos, a infecção neurológica nessas duas espécies apresenta características similares. Variações marcantes de neuropatogenicidade entre as amostras de vírus, assim como diferentes graus de susceptibilidade associados com a idade dos animais puderam ser observados na infecção pelo BHV-5 em coelhos, a exemplo do que tem sido demonstrado em bovinos (Belknap et al. 1994, Cascio et al. 1999). Estudos anteriores em bovinos demonstraram que inoculação de bezerros recém-nascidos (um a três dias de idade) com o BHV-5 produziu infecção cerebral fulminante acompanhada de sinais neurológicos e alterações inflamatórias severas que culminaram com a morte dos animais (Belknap et al. 1994). Em contraste, bezerros com cinco a seis meses de idade inoculados com a mesma amostra de vírus não desenvolveram enfermidade neurológica (Cascio et al. 1999). A enfermidade em coelhos, apesar do curso rápido, dos sinais neurológicos típicos e presença de vírus em diversas àreas do encéfalo, geralmente não é acompanhada de alterações inflamatórias severas, como observado em bovinos (Silva et al. 1999). No entanto, doença neurológica aguda fulminante, sem alterações inflamatórias severas também já foram observadas em bovinos inoculados com o BHV-5 (Beltrão 2000).

A reprodução de enfermidade neurológica pelo BHV-5 em coelhos foi recentemente relatada por vários grupos (Meyer et al. 1997, Chowdhury et al. 1997, Silva et al. 1999). A técnica de inoculação intranasal através de incisão cutânea e trepanação dos seios paranasais (Brown & Field 1990), posteriormente modificada por Silva et al (1999), permite a inoculação de volumes consideráveis de suspensão viral (>1ml por animal), com o mínimo de trauma, resultando em boa distribuição do inóculo na cavidade nasal. A coleta de suabes nasais para o monitoramento da replicação viral, no entanto, segue representando um problema devido à pequena abertura e grande sensibilidade das narinas. Alguns desses estudos relataram a necessidade de tratamento prévio dos animais com dexametasona para a produção da enfermidade (Chowdhury et al. 1997), o que não foi necessário nos experimentos descritos no presente estudo e nos relatos de Silva et al. (1999).

Os estudos de patogenia da infecção pelo BHV-5 sugerem o sistema olfatório como a principal via de acesso do BHV-5 ao encéfalo de coelhos após inoculação intranasal (Chowdhury et al. 1997,1999, Silva et al. 1999). O estudo da cinética da invasão do SNC (Quadro 2) revelou que o vírus atinge inicialmentwe o bulbo olfatório e córtex olfatório já às 48 horas pós-inoculação; e às 72hpi já pode ser detectado no tronco cerebral e córtex cerebral. A ampla disseminação do vírus no SNC após as 72hpi dificultou investigações mais detalhadas sobre outras vias de invasão e de disseminação. Os resultados do experimento com coelhos submetidos à ablação do bulbo olfatório reforçaram a hipótese de que o acesso do BHV-5 ao encéfalo de coelhos após inoculação intranasal ocorre principalmente pelo sistema olfatório. No entanto, esse experimento também demonstrou que o sistema olfatório não é a única via utilizada pelo BHV-5 para invadir o SNC. Recentemente, foi demonstrado que o BHV-5 estabelece infecção latente no gânglio trigêmeo de coelhos após inoculação intranasal e que a reativação da infecção latente é freqüentemente seguida de recrudescência da doença neurológica (Caron et al. 2000). Esses resultados, aliados à ocorrência de meningo-encefalite fatal em coelhos inoculados pela via intra-conjuntival (Quadro 1) indicam que as vias nervosas que compõe o nervo trigêmeo também podem ser utilizadas pelo BHV-5 para invadir o cérebro de coelhos. O curso tardio da enfermidade nesses animais, no entanto, sugere que a provável invasão por essa via é menos eficiente e mais tardia quando comparada com a via olfatória.

Os objetivos dos experimentos de proteção por imunização ativa foram avaliar a adequação desse modelo animal para estudos imunológicos, sem a pretensão de responder conclusivamente as questões pertinentes. Portanto, os resultados desses experimentos devem ser considerados preliminares e interpretados com cautela, enquanto não forem confirmados por estudos adicionais nos hospedeiros naturais. Não obstante, foi demonstrado que o modelo experimental proposto por Silva et al. (1999) parece ser apropriado para estudos de diversos aspectos da resposta imunológica ao BHV-5. Testes preliminares de proteção vacinal, formulações de adjuvantes e vacinas, e regimes de imunização poderiam potencialmente ser realizados em coelhos. Anteriormente, proteção parcial de coelhos através de imunização (imunização das coelhas-mães com o BHV-5) já havia sido demonstrada (Silva et al. 1999).

As diferenças antigênicas entre o BHV-5 e BHV-1 podem ser evidenciadas com o uso de anticorpos monoclonais contra as glicoproteínas do envelope viral (Metzler et al. 1986, Friedli et al. 1987, Roehe et al. 1997). No entanto, testes sorológicos de rotina muitas vezes são incapazes de distinguir entre esses dois vírus. Proteção cruzada entre o BHV-1 e BHV-5, através de imunização ativa e passiva, já foi demonstrada experimentalmente em bovinos (Belknap et al. 1994, Cascio et al. 1999). Essa reatividade sorológica cruzada tem sido responsabilizada, em parte, pela baixa prevalência do BHV-5 e pela ocorrência rara da enfermidade neurológica em países que vacinam regularmente contra o BHV-1 (Studdert 1989, d'Offay et al. 1995). Os resultados obtidos com o experimento de imunização ativa em coelhos, demonstram que a reatividade sorológica cruzada entre o BHV-1 e BHV-5 pode traduzir-se em proteção cruzada. Os maiores índices de proteção observados entre coelhos imunizados com o BHV-1 podem ser atribuídos à maior dose de vírus utilizada para imunização (quase 1log ₁₀ maior), como também a uma possível influência de diferenças antigênicas do BHV-1, levando a uma resposta mais eficaz em termos de proteção.

Em resumo, os resultados obtidos nesse trabalho demonstram a utilidade de coelhos para a investigação de vários aspectos da infecção neurológica pelo BHV-5. Ressalvadas as diferenças existentes entre coelhos e os hospedeiros naturais do BHV-5, as semelhanças observadas na infecção dessas espécies justificam o uso de coelhos como modelo experimental. Certamente, a disponibilidade de um modelo experimental adequado auxiliará no esclarecimento dos mecanismos biológicos e moleculares responsáveis pelo potencial neuropatogênico desse vírus.

Agradecimentos.- Ao Médico Veterinário Antoninho Macuglia (Biotério Central) e à Professora Ione Denardin (Colégio Agrícola da UFSM) pelo fornecimento dos coelhos. Aos colegas Dr Paulo M.Roehe (CPVDF - Centro de Pesquisas Veterinárias Desidério Finamor), Dr Anselmo Odeon (INTA Balcarce, Argentina) e Dra Elba Laura Weber (INTA Castelar, Argentina) pelas amostras de BHV-5. Aos bolsistas e funcionários do Laboratório de Virologia da UFSM pelos cuidados e manutenção dos coelhos. Ao Dr H-Jung Sur (Plum Island Animal Disease Center, Greenport, NY) pela realização dos testes de hibridização in situ.

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