Caracterização imunoquímica da acc (ácido 1-carboxílico-1-aminociclopropano) oxidase em frutos climatéricos

Com o objetivo de caracterizar, por via imunoquímica, a enzima ACC (ácido 1-carboxílico-1-aminociclopropano) oxidase em frutos climatéricos, foram preparados anticorpos policlonais específicos para esta proteína. Utilizou-se, como antígeno, uma proteína recombinante, produzida em Escherichia coli K38/pGP_1,2, contendo o vetor de expressão pT7-7A4 no qual foi inserido um clone de DNA da ACC oxidase. A especificidade dos anticorpos foi demonstrada pela técnica de "Western blot", a partir de extratos protéicos de maçãs e tomates em diferentes estágios de maturação. Verificou-se que o aumento da produção de etileno, quando os frutos passaram do estágio pré-climatérico para o climatérico, está diretamente correlacionada com o aumento da síntese da ACC oxidase. Em estágios de maturação mais avançados houve uma redução da produção de etileno e da atividade ACC oxidase, mas esta proteína continuava presente. Quando o "Western blot" foi realizado com tomates transgênicos, onde a produção de etileno e a síntese da ACC oxidase foram inibidos em mais de 95%, nenhuma reação imunoquímica foi detectada. O conjunto de resultados obtidos indica que os anticorpos detectam especificamente ACC oxidase.

Palavras-chave: etileno, ACC (ácido 1-carboxílico-1-aminociclopropano) oxidase, anticorpos, frutos climatéricos.

IMMUNOCHEMICAL CHARACTERIZATION OF ACC (1-AMINOCYCLOPROPANE-1-CARBOXILIC ACID) OXIDASE IN CLIMACTERIC FRUITS. Polyclonal antibodies were prepared to characterize the enzyme ACC (1-aminocyclopropane-1-carboxilic acid) oxidase from climateric fruits. The antigen was a recombinant protein obtained from an Escherichia coli K38/pGP_1,2, which contained the expression vector pT7-7A4 with one ACC oxidase DNA clone inserted. Antibody specificity was demonstrated by the Western blot technique with protein extracts from apples and tomatoes in different maturation stages. It was observed that the increase in ethylene production which happened when the fruits changed from pre-climateric to climateric stage is directly correlated with an increase in ACC oxidase syntesis. In more advanced maturation stages there was a reduction in ethylene production and ACC oxidase activity, however the protein was still present. There was no immunochemical reaction in Western blot performed with transgenic tomatoes, which had a 95% reduction of etylene production and ACC oxidase syntesis. This results suggest that the antibodies detects ACC oxidase specifically.

Key-words: ethylene, ACC (1-aminocyclopropane-1-carboxilic acid) oxidase, antibodies, climacteric fruits.

O etileno é um fitoregulador de crescimento associado a praticamente todas as etapas fenológicas do desenvolvimento, desempenhando, entretanto, papel fundamental na indução da maturação/senescência de frutos climatéricos. A síntese do etileno é fortemente estimulada por fatores exógenos como as infecções fúngicas, bacterianas e/ou virais, as injúrias físicas ("chilling injury") e mecânicas (danos mecânicos), os estresses térmicos e hídricos, além da resposta autocatalítica. Este envolvimento generalizado nos eventos fisiológicos do crescimento e desenvolvimento dos vegetais faz com que este hidrocarboneto seja, em alguns casos, causa (maturação, por exemplo) e, em outros, conseqüência do processo (resposta a estresses, por exemplo) (10, 13, 14, 20).

A via de biossíntese do etileno compreende a conversão da S-adenosil metionina em ácido 1-carboxílico-l-aminociclopropano (ACC), sob a ação da ACC sintetase e a conversão do ACC em etileno, pela ação da enzima formadora do etileno (EFE) ou ACC oxidase. Dezenas de trabalhos citados por KENDE (10), foram realizados buscando caracterizar, isolar, purificar à homogeneidade e seqüenciar algumas isoformas de ACC sintetase, bem como dos respectivos clones de DNA e os genes envolvidos.

Grande parte destas descobertas se deu graças aos avanços obtidos nas técnicas de Biologia Molecular e de Imunoquímica, onde foram preparados anticorpos mono e policlonais dirigidos para as diferentes isoformas de ACC sintetase. Isto permitiu melhor compreender mecanismos de expressão desta enzima.

No que concerne à ACC oxidase, somente em 1991 é que VERVERIDES & JOHN (19) conseguiram isolar esta enzima num sistema acelular e dosar sua atividade in vitro. A descoberta da natureza e das propriedades da ACC oxidase resultou em importantes avanços no esclarecimento dos mecanismos fisiológicos e moleculares da maturação de frutos climatéricos. Assim, foram isolados clones de DNA e genes da ACC oxidase em tomate (08), maçã (06) e melão (12).

HAMILTON et al. (08) foram os primeiros pesquisadores a isolar um clone de DNA da ACC oxidase de tomate, denominado pRC13. Eles demonstraram que leveduras transformadas com o pRC13, quando incubadas em presença de ACC, ferro e ascorbato, eram capazes de sintetizar etileno. Já naquelas não transformadas com este clone nenhuma quantidade de etileno foi produzida.

Com base nessas informações e utilizando o pRC13 como sonda heteróloga, DONG et al. (06) isolaram um clone de DNA da ACC oxidase em maçã, cv. Golden Delicious, e BALAGUÉ et al. (02), um clone desta mesma enzima em melão, cv. Galia.

Mais recentemente, LASSERE et al. (12) caracterizaram três genes funcionais da ACC oxidase em melão: ACCO1, envolvido na maturação dos frutos; ACCO2, na elongação de hipocótilos; e ACCO3, na antese. Na mesma época, BARRY et al. (03) também caracterizaram três genes da ACC oxidase em frutos de tomate: TOM1, expresso durante a maturação dos frutos; TOM2, expresso em tecido submetido à injúrias mecânicas; e TOM3, em material infectado por fungos. Em todos os casos, a homologia das seqüências das regiões traduzidas dos genes é superior a 85%.