Enviado por Octávio Luiz Franco
As pragas e os patógenos (fungos, bactérias e vírus) são responsáveis por grandes perdas da agricultura, por causarem injúrias e doenças, além de se alimentarem dos tecidos de plantas. As perdas na produção da agricultura mundial, devido ao ataque de pragas e doenças, chegam a 37%, sendo 13% dessa perda causada por insetos (Gatehouse et al., 1992). As plantas possuem entretanto, um certo grau de resistência a insetos e, há muitos anos, tem-se estudado a biossíntese e a regulação de compostos químicos de plantas associados com essas defesas. Atualmente, sabe-se que esses defensivos são encontrados em vários tecidos vegetais e entre esses compostos estão incluídos antibióticos, alcalóides, terpenos e proteínas. Entre as proteínas, estão incluídas enzimas tais como as quitinases, as lectinas e os inibidores de enzimas digestivas (Ryan, 1990). Atualmente, genes que conferem resistência a insetos podem ser introduzidos em plantas de interesse para reduzir sua susceptibilidade. Esses genes podem ser obtidos de plantas, bactérias ou de outra origem (Walker et al.,1997). Os inibidores de enzimas (a- amilases e de proteinases) serão aqui descritos e estudados, relacionando-se suas funções como compostos de defesas de plantas contra insetos e seu potencial como ferramenta na obtenção de plantas resistentes a pragas.
Palavras-chave: inibidores de amilase, inibidores de proteinase, defesa de plantas, bruquídeos de feijão.
As a-amilases são enzimas monoméricas que constituem uma família de endoamilases e catalisam a hidrólise de ligações glicosídicas a-1,4 do amido, glicogênio e outros carboidratos. Essas enzimas têm um papel importante no metabolismo de carboidratos em plantas, animais e outros organismos. Por serem essenciais para o crescimento e o desenvolvimento de muitos insetos, especialmente daqueles que vivem em sementes e grãos ricos em amido, muitos estudos têm sido feitos no intuito de desvendar o funcionamento das a-amilases (Grossi de Sá & Chrislpeels, 1997, Chrispells et al. 1988, Da Silva et al., 1999) e de descobrir proteínas com função inibitória a essas enzimas digestivas de insetos. As plantas apresentam várias proteínas com essa função e, portanto, são denominadas inibidores de a-amilase. Esses inibidores podem ser encontrados em cereais (Feng et al., 1996; Franco et al., 1999), em leguminosas (Ishimoto et al., 1996, Grossi de Sá et al., 1997) e em outras famílias de vegetais. Estes inibidores podem apresentar massa molecular de 5 kDa, 13 kDa (monômeros), 26 kDa (dímeros) e 50 kDa (tetrâmeros). Entre os inibidores de a-amilase mais estudados estão os encontrados no trigo (Triticum aestivum): 0.19 e 0.53, nomeados de acordo com sua mobilidade eletroforética, e os inibidores do feijão comum (Phaseolus vulgaris). No feijão, foi demonstrada a presença de dois inibidores de37a-amilase, chamados a- AI1 e a-AI2, que diferem em suas especificidades contra diferentes a- amilases. Enquanto o a-AI1 inibe a-amilase de pâncreas de porco (PPA) assim como as a-amilases dos bruquídeos Callosobruchus maculatus (CMA) e de Callosobruchus chinensis (CCA) (Kasahara et al., 1996), o inibidor a-AI2 inibe as a-amilases do Zabrotes subfasciatus (ZSA) (Grossi de Sá and Chrispeels, 1997). Nenhum desses inibidores presentes em sementes de feijão teve efeito contra as a-amilases do bruquídeo Acanthoscelides obtectus (AOA). Três importantes bruquídeos-pestes de grãos armazenados de feijão Z. subfasciatus, C. maculatus e A. obtectus (Figura 1) são responsáveis por perdas substanciais na agricultura do Brasil, América Latina e parte central da África. As larvas desses bruquídeos penetram dentro da semente apesar da presença de fatores de resistência, tais como inibidores de a-amilase e proteinase. Isso pode ser explicado pela teoria da co-evolução (Ehrlich & Raven, 1964) que sugere que a produção e o acúmulo de uma toxina pela planta é seguido por uma resposta do predador, tal como a detoxificação ou a excreção da toxina. Esse fato capacitaria o inseto a se alimentar da planta alvo.
Figura 1:
A) Feijões infestados por A. obtectus. B) Feijões danificados por larvas de A. obtectus e C) Inseto adulto
Com o intuito de identificar inibidores ativos e específicos contra as a-amilases de tais bruquídeos, o inibidor 0.53 foi purificado a partir de sementes de trigo (T. aestivum) cv BR35. As sementes foram maceradas e as proteínas extraídas com uma solução de NaCl 0,15 M (1:5 p/v), seguido do fracionamento com sulfato de amônio (20-40%). Essa fração foi, então, aplicada em uma coluna HPLC semi-preparativa de fase reversa (Vydac 218 TP 1022 C-18). O ensaio inibitório (Figura 2) feito de acordo com Bernfeld (1964) mostra que o inibidor dimérico 0.53 é ativo contra as a-amilases de Bacillusamyloliquefasciens e contra a-amilases CMA, ZSA, AOA (Franco et al., 2000). Esse inibidor, entretanto, apresentou baixa atividade contra a a-amilase do pâncreas de porco (PPA). O inibidor 0.53, juntamente com o 0.19 (Franco et al., 1999) são os únicos fatores de resistência ativos contra o bruquídeo A. obtectus descritos até o momento.
O mecanismo de interação e especificidade inibidor-amilase é extremamente complexo e, embora ainda totalmente não desvendado, alguns avanços têm sido demonstrados nessa área. Recentemente, Grossi de Sá et al. (1997) mostraram que a inibição de ZSA, causada pelo a-AI2, é dependente tanto do tempo quanto do pH. Em adição, La Jolo et al. (1991) demonstrou que a formação do complexo tem pH ótimo de 5,5 e inibem assim as a-amilases de alguns Coleópteros, os quais possuem um pH ácido em seu intestino médio, e não inibem as a- amilases de Lepdópteros, que possuem um pH alcalino em seu intestino médio. Kasahara et al. (1996) sugeriram uma proporção estequiométrica de 2:1, onde uma única molécula de inibidor a-AI1, através de dois sítios de ligação independentes, se liga e inibe duas moléculas de amilase de PPA.
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