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O experimento foi conduzido no Laboratório de Cultura de Tecidos do Departamento de Botânica, Instituto de Biologia da Universidade Federal de Pelotas - UFPel, Pelotas - RS, no período de outubro de 2001 a abril de 2002.
O material vegetal utilizado para as análises foram cultivares de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cultivares de ameixeira européia (Prunus domestica L.) e a cultivar Mirabolano 29C (Prunus cerasifera Ehrh.), conforme consta na Tabela 1. Obteve-se o DNA de 70 mg de folhas liofilizadas e a extração realizada conforme metodologia descrita por Mulcahy et al. (1993), com modificações descritas por Bianchi et al. (2002). Após tratamento com RNAse, o DNA foi quantificado e diluído em água estéril para concentração final de 15 ng.mL-1, para utilização na reação de polimerização em cadeia (PCR).
Para as amplificações utilizou-se um total de 17 "primers" decâmeros dos kits da Operon – OP (OP A01, OP A07, OP A15, OP A17, OP A18, OP A20, OP AC19, OP AC20, OP AD16, OP AF15, OP AN19, OP AN20, OP B01, OP B19 e OP B20) e da British Columbia University - UBC (UBC 407 e UBC 412). As reações de amplificação foram realizadas em um aparelho termociclador MJ PTC-100, utilizando o perfil térmico conforme Koller et al. (1993). O volume total da mistura de reação foi de 25 mL, contendo: 2,5 mL Tampão 10X (10 mM Tris-HCl pH 9,0, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2), 3,75 mM de cada dNTP, 10 mM de cada primer, 1 Unidade de Taq polimerase (Invitrogen) e 30 ng de DNA genômico, conforme descrito por Pancaldi et al. (2000).
Os produtos da amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,2%; a coloração feita com brometo de etídeo e as bandas visualizadas em luz ultravioleta. As reações de amplificação foram repetidas três vezes para cada "primer" e indivíduo, e para a análise somente foram considerados os dados dos "primers" que produziram bandas que se repetiram em todas as amplificações.
Os perfis eletroforéticos obtidos sobre o gel foram utilizados para a direta diferenciação entre genótipos e para a construção de uma matriz de similaridade genética, que foi elaborada com os dados produzidos por cada "primer", registrando-se a presença (1) e ausência (0) de bandas no perfil eletroforético para cada um dos genótipos. A similaridade genética foi calculada usando o coeficiente DICE GS (i j) = 2 a / 2 a + b + c, onde a = número de bandas polimórficas condivididas; b = número de bandas em i e c = número de bandas em j) com "software" NTSYS.pc versão 1.8 (Rohlf, 1993). Realizou-se análise de agrupamento para construir um dendrograma de similaridade, empregando o método UPGMA (Unweighted pair group mean average), de acordo com os dados obtidos com os marcadores RAPD.
Dos 17 "primers" RAPD testados foram utilizados somente os produtos amplificados de 12 "primers" (OP A01, OP A07, OP A15, OP A17, OP A18, OP A20, OP AC19, OP AD16, OP AN19, OP B01, UBC 407 e UBC 412), os quais produziram um total de 199 perfis. Destes, apenas 12 foram monomórficos e os demais, 187 (93,97%), foram polimórficos. Alguns produtos polimórficos são apresentados na Figura 1. O número médio de polimorfismos obtido por marcador foi de 15,58. Entre os 12 "primers" utilizados registrou-se a presença de 45 perfis únicos, sendo que Mirabolano 29C apresentou o maior número de bandas exclusivas (17 no total). Todos os marcadores geraram bandas únicas para alguns dos genótipos, variando de 2 a 7 bandas para os marcadores OP B01 e OP AD16 e para os marcadores OP A18 e OP AC19, respectivamente. A única exceção foi o marcador OP A07 que não produziu nenhuma banda característica.
Os marcadores utilizados permitiram diferenciar de maneira bastante segura cada genótipo de ameixeira analisado. Porém, Byrne & Littleton (1988) verificaram que o uso de isoenzimas para o "fingerprinting" de 29 cultivares de ameixeira não permitiu identificar todos os genótipos, mas apenas 38% do total analisado. Os resultados obtidos neste trabalho, com os marcadores RAPD, confirmam o alto grau de polimorfismo entre as diferentes espécies e cultivares de ameixeira, conforme verificado por Gregor et al. (1994), Ortiz et al. (1997) e Bianchi et al. (2002). Isso pode também ser atribuído à presença de cultivares de três espécies diferentes (Tabela 1), P. salicina, P. domestica e P. cerasifera (Mirabolano 29C), esta última incluída no conjunto de genótipos para verificar o potencial de uso da técnica RAPD em separar cultivares de diferentes espécies do mesmo gênero. Considerando somente os perfis eletroforéticos das ameixeiras japonesas também se obteve alto polimorfismo, com um total de 150 bandas, destas, 134 (89,33%) foram polimórficas e 16 (10,67%) monomórficas. Em trabalho conduzido por Bianchi et al. (2002), as cultivares Santa Rosa, Letícia, Santa Rita, Pluma 7, América e Reubennel foram analisadas com marcadores moleculares SSR e AFLP e com uma única combinação de "primers" AFLP foi suficiente identificar as seis cultivares como P. salicina, o mesmo aconteceu quando utilizado o marcador SSR UDP96-019. Os resultados obtidos por estes autores estão em concordância com aqueles obtidos neste trabalho, verificando-se que o agrupamento destas seis cultivares ocorreu de maneira similar ao obtido com os marcadores AFLP e SSR.
O uso de marcadores RAPD permitiu uma clara separação das 3 espécies de ameixeira analisadas (Figura 2). Com o uso de 12 marcadores RAPD, a maior similaridade genética foi observada entre as cultivares de Prunus salicina, Irati e Amarelinha (83.06%), seguido das cultivares de P. doméstica, Stanley e D'Agen (81,89%).
No grupo da espécie P. salicina (Figura 2), verifica-se que as cultivares The First e Ozark Premier apresentam-se com maior distância genética em relação às outras cultivares desta espécie, a qual pode ser atribuída a possível contribuição de outras espécies, como P. domestica e P. cerasifera, na constituição genética destas cultivares. O caráter híbrido da ameixeira é confirmado com base na constituição genética da cultivar Ozark Premier (Burbank x Methley) ¾ de P. salicina + ¼ de P. cerasifera (Byrne & Littleton, 1988). Ortiz et al. (1997) também atribuem esta alta variabilidade genética observada entre cultivares de ameixeira a parcial auto-incompatibilidade que existe entre os diferentes genótipos.As demais cultivares de P. salicina, pela distribuição no dendrograma, possivelmente possuem na constituição genética contribuição, principalmente, de P. salicina, P. americana e P. simonii, conforme relatado por Byrne & Littleton (1988), para as cultivares Santa Rosa, Frontier e Wade.
As cultivares de P. domestica ficaram em um grupo intermediário no dendrograma, tendo Mirabolano 29C separado de todos os demais genótipos (Figura 2). Esse dado leva a interpretar que P. cerasifera é mais próxima geneticamente de P. domestica que de P. salicina. De acordo com Watkins, 1976 apud Bellini et al. (1998), isso ocorre devido a P. cerasifera ter o centro de origem geográfica próximo do centro de origem de P. domestica (Leste Europeu). Por outro lado, Reynders & Salesses (1991) sugerem que as ameixeiras hexaplóides (P. domestica) tenham sido originadas de formas poliplóides de P. cerasifera. De qualquer forma, ambas teorias confirmam a existência de parentesco entre estas duas espécies.
A caracterização molecular de genótipos de ameixeira, analisados neste trabalho, pode ser realizada de forma eficiente através dos marcadores RAPD. Resultados significativos foram obtidos com estes marcadores, permitindo estimar a variabilidade genética entre genótipos de ameixeira e diferenciação das espécies.
NOTA
1. (Trabalho 119/2002). Parte da tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Agronomia, Faculdade de Agronômia Eliseu Maciel, Universidade Federal de Pelotas, pelo primeiro autor, como requisito para obtenção do título de Doutor em Ciência. Trabalho desenvolvido com apoio financeiro do CNPq e Fapergs
Valmor João BianchiI,*; José Carlos FachinelloII; Márcia Wulff SchuchIII
vbianchi[arroba]ufpel.tche.br
I* Autor para correspondência.
Engº. Agrº. M. Sc., Bolsista do CNPq, Doutorando do CPGA-FAEM-UFPel, Campus Universitário, Fone: (53) 2757124, CP. 354, CEP 96010-900, Pelotas-RS-Brasil. E-mail: valmorjb[arroba]yahoo.com
IIEngº. Agrº., Dr., Prof. Titular Depart. Fitotecnia, FAEM-UFPel, (53) 2757124, C.P. 354, 96010-900, Pelotas-RS-Brasil
IIIEngº. Agrº., Dra., Prof. Adjunto Depart. Fitotecnia, FAEM-UFPel, (53) 2757124, C.P. 354, 96010-900, Pelotas-RS-Brasil
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