Fluxo biológico do fósforo no metabolismo de suínos alimentados com dietas contendo fitase (página 2)

Foram utilizados 16 suínos mestiços, machos castrados, com peso médio de 31,68±1,62 kg. O experimento teve duração de 17 dias, sendo dez correspondentes à fase pré-experimental e sete à fase de coletas.

Os quatro tratamentos (Tabela 1) foram constituídos por uma ração composta por milho, farelo de soja, farelo de arroz desengordurado (FAD) e óleo de soja, suplementada com níveis crescentes de fitase (253, 759, 1265 e 1748 UF/kg de ração). As rações foram formuladas para suprir as exigências dos suínos, exceto em P, seguindo as recomendações do NRC (1998) e Rostagno et al. (2000).

No primeiro dia da fase experimental, cada animal recebeu, por via endovenosa, 0,5 mL de uma solução radioativa com 7,4 MBq de ³²P. A solução radioativa, preparada de acordo com Vitti (1989), constituía-se de fosfato de sódio (Na₂H³²PO₄), livre de carregador, adquirida no Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN).

Nos três últimos dias da primeira fase, foram coletadas amostras de fezes para determinação do P inorgânico.

Após a aplicação do material radioativo, foram coletadas diariamente amostras de sangue, de fezes e de urina. No final do período experimental, os suínos foram sacrificados e as amostras de tecidos (osso, músculo, coração, fígado e rim), coletadas.

As amostras de sangue foram centrifugadas imediatamente após a coleta, em 3.000 rpm, durante 10 minutos, e o plasma separado. Para detecção da radioatividade, 0,5 mL de plasma foi adicionado em água deionizada, em frasco de contagem; a determinação foi obtida por efeito Cerenkov (Nascimento Filho & Lobão, 1977; IAEA, 1979). Ao volume de 1 mL de plasma adicionaram-se 9 mL de ácido tricloroacético (10%), determinando-se o teor de fósforo inorgânico por colorimetria.

As fezes foram coletadas durante sete dias, pesadas, maceradas e homogeneizadas. Um grama desta porção foi colocado em cadinhos de porcelana para as determinação de matéria seca (100ºC) e de cinzas (500ºC). As cinzas foram digeridas em 10 mL de ácido sulfúrico (18 N); o material digerido foi colocado em frascos de cintilação, completando-se o volume para 20 mL com água destilada, para determinação da radioatividade por efeito Cerenkov. Cerca de 1 g de fezes foi digerido com 5 mL de ácido clorídrico concentrado, seguindo-se filtragem e ao volume de 2,5 mL do filtrado foram adicionados 2,5 mL de água deionizada e 2 mL de reagente misto (quantidades iguais de molibdato de amônia a 5% e vanadato de amônia a 0,25%). As leituras do P inorgânico foram feitas por colorímetro.Das amostras de urina coletada, 0,5 mL foi diluído em 19,5 mL de água deionizada, e a atividade foi determinada por efeito Cerenkov. O fósforo inorgânico foi determinado da diluição de 1 mL de urina em 9 mL de ácido tricloroacético (10%).

As análises bromatológicas das dietas foram realizadas de acordo com as recomendações da AOAC (1980). Para determinação do P inorgânico do plasma e dos tecidos, seguiu-se o método descrito por Fiske & Subbarrow (1925). A atividade do radionuclídeo foi determinada por efeito Cerenkov, em espectrômetro de cintilação líquida (Nascimento Filho & Lobão, 1977). O teor de P nas dietas foi calculado de acordo com Sarruge & Haag (1974); as atividades específicas, conforme Lofgreen (1960); e o P endógeno, segundo Vitti (1989).

O modelo matemático proposto para o estudo do fluxo de P em suínos (Figura 1) baseou-se nos estudos de Fernandez (1995) e Lopes et al. (2001), combinando dados dos estudos de metabolismo e cinética do P nos tecidos.

Foi adotado o modelo determinístico e compartimental, em que o compartimento C-1 é o trato gastrintestinal; C-2, o plasma; C-3, os ossos; e C-4, os tecidos moles, sendo o fígado, coração, rim e músculo estudados em conjunto, de acordo com a proporção de seus pesos.

Os parâmetros foram estimados por meio de equações envolvendo as seguintes variáveis: P consumido (V_I), P total excretado nas fezes (V_F), com as frações de origem alimentar (V_FD) e endógena (V_f), P excretado na urina (V_U), absorção de P de origem alimentar (V_aa) e reabsorção do fósforo de origem endógena (V_af), valor da fração de P endógeno, proveniente de secreções e de células de descamação, que chega ao trato gastrintestinal (V_IT), absorção total de P, incluindo as frações de origem endógena e alimentar (V_aT) e balanço de P (B_a), definidas segundo Fernandez (1995) (equações 1 a 6). O valor P proveniente do total absorvido (V_aT) que retorna ao trato gastrintestinal (V_eD1) foi calculado pela diferença entre o P do V_aT e o P incorporado em C₃ e C₄, após subtrair-se o P reciclado que retorna a estes compartimentos. O restante do total absorvido (V_eD2) foi distribuído proporcionalmente entre C₃ e C₄ (V_0+T e V_0+D), de acordo com as equações 7 — 10.

Na determinação do P incorporado no osso (V₀₊) e nos tecidos moles, fígado, coração, rim e músculo (V_Te+), considerou-se a concentração de P (mg/gMS). O percentual de ³²P [(cpm amostra/g de MS)/(dose total injetada)]/[(mgP/g MS)] e a atividade específica dos tecidos [(% da atividade injetada de ³²P)/(mgP/gMS do tecido)] foram calculados de acordo com Lopes (1998). Para o ³²P retido nos tecidos moles, foi considerada a média dos valores encontrados em cada tecido estudado.

A quantidade de matéria seca (MS) de cada tecido foi determinada pelo produto entre o percentual de MS obtida e o peso dos tecidos, definidos segundo dados de pesquisa de Davidson (1966) e Lopes (1988).

Neste processo, foi utilizado, ainda, os decaimentos físico T1/2 e biológico (Tb) do ³²P, fundamentado na IAEA (1979), uma vez que os animais foram sacrificados uma semana após a aplicação do ³²P e a contagem do material radioativo, efetuada oito dias após o abate.

O valor do ³²P retido (mg/gMS) foi determinado pelo produto do percentual de ³²P retido e a concentração total de P nos compartimentos C-1 e C-3 (mg/gMS).

Após a correção do decaimento do ³²P para a data da sua introdução na corrente sangüínea, calculou-se o P incorporado (mg/g MS) nos compartimentos 3 e 4 pela relação entre o valor de ³²P corrigido e o da atividade específica em cada compartimento envolvido. O P total incorporado (mg) nos compartimentos C₃ e C₄ foi obtido pelo produto entre a MS (g) do compartimento e o P incorporado (mg) pelo produto entre a MS (g) do compartimento e o P incorporado (mg/gMS). Os valores de V₀₊ e V_Te+ (mgP/kgPV.dia) foram obtidos pela relação entre o P total incorporado no compartimento e o peso do animal (g). As equações 11 a 24 caracterizam essas determinações.

O P reabsorvido nos compartimentos C-3 (V_0-) e C-4 (V_Te-) foi calculado deduzindo-se, respectivamente, de V₀₊ e de V_Te+ o valor do balanço de P multiplicado pela proporção de P incorporado no compartimento em estudo (equações 25 e 26).

Para determinação do P reciclado que retorna aos compartimentos C-3 e C-4 (V_0+R1 e V_0+R2) e ao trato gastrintestinal (V_eo — V_eT), o cálculo foi realizado com base nas equações 27 a 30, segundo Fernandez (1995) e Lopes et al. (2001), adaptando-se ao modelo a proporção incorporada em cada um dos dois compartimentos, visto que neste trabalho o osso foi considerado como o único compartimento que mobilizou P. O valor do P proveniente dos ossos e tecidos moles, reciclado para os tecidos moles (V_0+R), o do P do V_0+R, reincorporado nos tecidos moles (V_TO1) e o P do V_o+R reincorporado nos ossos (V_T02) foram determinados de acordo com as equações 31 a 33.

O delineamento experimental foi inteiramente ao acaso com quatro tratamentos e quatro repetições para as variáveis relacionadas com o metabolismo e três para as variáveis dos tecidos.

As variáveis do modelo foram submetidas a análises de variância e de regressão polinomial, utilizando-se o procedimento PROC GLM. A derivação da equação quadrática, para obtenção dos pontos máximo e mínimo, foi obtida pelo LAB, ambos pertencentes ao programa SAS (1991).

Os resultados das variáveis relacionados ao fluxo do P no metabolismo de suínos em crescimento são apresentados nas Tabelas 2 e 3. Os níveis crescentes de enzima fitase não influenciaram o P consumido, resultado esperado, pois, neste estudo o consumo de ração foi padronizado.

As variáveis: V_FD, V_IT e V_af não foram afetadas pela fitase (P>0,05). O V_IT é proveniente do turnover celular e de secreções no trato gastrintestinal, utilizado como rota metabólica para a excreção do excesso de P no plasma e o V_af representa o retorno de parte do V_IT para o sangue.

Os valores obtidos para o V_IT (18,88; 11,87; 13,43 e 18,29 mgP/kgPV) não são proporcionais aos obtidos para o V_af (6,14; 5,14; 4,75 e 5,18 mgP/kgPV.dia), uma vez que os níveis de 253 e 1748 UF, embora tenham apresentado valores mais altos para o V_IT, apresentaram níveis de V_af semelhantes aos demais, em decorrência da taxa de passagem no trato digestivo, que se altera de acordo com as características do alimento ingerido.

A ingestão de alimentos deficientes em P pode provocar elevação temporária da concentração do P no plasma e, conseqüentente, aumentar as perdas endógenas e urinárias. Tal afirmação pode ser corroborada pelos resultados obtidos por Fernandez (1995), que observou comportamento similar com altos e médios níveis de P (334,29 e 220 mg/kg PV.d), e Lopes et al. (2001), que obtiveram para o V_IT valor numericamente maior para o tratamento sem fonte inorgânica de P (0,30 % de P total), quando comparado com o fosfato de Tapira, fosfato Patos de Minas e fosfato supertriplo (0,56 % de P total). Dessa maneira, valores mais altos para o V_IT podem não significar melhor aproveitamento do P, sendo necessária uma análise em conjunto com outras variáveis do modelo.

Observou-se efeito quadrático entre o V_f e os níveis crescentes de fitase (P<0,05), conforme a equação = 1,269 — 0,0009X + 0,000000453X²; R² = 0,72, com ponto mínimo em 993 UF — limite de resposta da enzima. As excreções endógenas fecais de acordo com Breves & Schroder (1991) representam uma rota de excreção metabólica importante para o controle homeostático do fósforo no plasma, em animais monogástricos. As variáveis V_F e V_U não foram afetadas pela fitase, mas para V_F o nível 759 UF apresentou o menor valor, sendo a melhor resposta ao uso da enzima. A fitase hidroliza os grupos ortofosfatos das moléculas de ácido fítico, disponibilizando o P e outros minerais para o metabolismo e reduzindo a excreção fecal (Harper et al., 1997; Conte, 2000; Matsui et al., 2000). Todo o P não-absorvido pelos animais é excretado nas fezes, juntamente com a fração endógena, o que pode acarretar prejuízos ao meio ambiente (Lei et al., 1993).

O balanço geral de P foi obtido pela diferença entre a entrada e saída do modelo. Observou-se efeito quadrático (P<0,05) dos níveis de fitase sobre o balanço geral de P, = 53,132+0,132X-0,00007X²; R² = 0,89, com ponto máximo em 943 UF. Da mesma forma, foi observado para as variáveis V_aa, que representa a absorção líquida, = 70,79+0,111X-0,00006X²; R² = 0,88, ponto máximo de 925 UF, e P total (V_aT), = 77,741+0,1074X-0,00006X²; R² = 0,89, ponto máximo de 895 UF, demonstrando que a enzima fitase foi eficiente em catabolizar o fitato disponibilizando o P para o metabolismo dos animais.

Figueirêdo et al. (2000), trabalhando com dietas formuladas com milho, farelo de soja e farelo de arroz integral para suínos, constataram que a fitase influenciou positivamente a absorção real. Segundo os autores, a ação da fitase aumentou em 40,78% a utilização do P fítico. Ketaren et al. (1993), avaliando os efeitos da fitase em suínos em crescimento e terminação, observaram que a suplementação de 1.000 UF/kg de dieta elevou em 53% a digestibilidade aparente do fósforo do farelo de soja. Conte (2000), avaliando os efeitos de níveis crescentes de fitase (0, 400, 800, 1200 UF/kg de dieta) em dietas balanceadas com farelo de arroz integral para aves, observou efeito quadrático para P absorvido aparente, com resposta máxima no nível 750 UF. Estes trabalhos estão em consonância com o presente estudo quanto à ação da enzima em disponibilizar o P da molécula de fitato para o metabolismo.

O refluxo do P total absorvido para o trato gastrintestinal (V_eD1) não foi afetado pela enzima fitase, apresentando valores superiores (10,95; 8,26; 9,07 e 9,05 mgP/kgPV.dia) ao encontrado por Lopes et al. (2001), para o tratamento sem fonte inorgânica de fósforo, que obtiveram o valor de 3,05 mgP/kgPV.dia, e semelhante aos observados para os fosfatos bicálcico e monoamônio (8,07 e 10,92 mgP/kgPV.dia).

A fração do P total absorvido destinado aos ossos e tecidos moles (V_eD2) foi influenciada pela fitase, apresentando efeito quadrático (P<0,05), = 65,554+0,1138X-0,00006X²; R² = 0,86, com ponto máximo em 948 UF. O mesmo efeito foi observado para a parte incorporada nos ossos (V_o+D) = 51,715+0,1071X-0,00006X²; R² = 0,86, com ponto máximo em 892 UF, e para o balanço de P no osso, = 41,66+0,1211X-0,00007X²; R² = 0,88, com ponto máximo em 865 UF.

As variáveis em conexão direta com ossos apresentaram maior sensibilidade para o estudo deste mineral, pois do V_aT cerca de 69% destinaram-se aos ossos, 15,18% aos tecidos, 15,38% ao trato gastrintestinal e 0,46 % à urina. Os ossos funcionaram como um centro de armazenamento e distribuição de P; dessa maneira, a quantidade de P necessária para maximizar o desenvolvimento dos ossos é diferente da exigida para o desempenho (Libal et al., 1969).

Moreira et al. (2001), utilizando dietas iguais às usadas neste experimento, porém, em ensaio de desempenho de suínos em crescimento, não observaram efeito sobre consumo de ração, conversão alimentar e ganho de peso diário, entretanto, para a porcentagem de P nas cinzas ósseas, verificaram efeito quadrático com resposta máxima no nível 880 UF. Este valor foi semelhante ao obtido neste estudo (865 UF), para a variável balanço de P no osso.

Para as variáveis V_eD1, V_o+T, V_o+, V_o-, V_oR2, V_oR1, V_oR, Vo_T2 e V_Te+, não foram detectados efeitos da fitase (P> 0,05), mas o P reabsorvido dos tecidos moles (V_Te-) apresentou efeito quadrático negativo (P<0,05), = 23,633-0,347X+0,00002X²; R² = 0,99, com ponto de mínimo em 867 UF. Este efeito foi antagônico ao observado para a variável V_aT.

Foi observada redução de forma quadrática (P<0,05) para o refluxo do P reciclado dos ossos (V_eo-), = 10,055-0,014X+0,000007X²; R² = 0,99, com ponto mínimo em 1000 UF. O mesmo efeito foi detectado para o refluxo do P dos tecidos moles destinado ao trato gastrintestinal e urina (V_eT-), = 2,3567-0,0042X+0,000002X²; R² = 0,99, com ponto mínimo em 1050 UF.

O metabolismo do fósforo está relacionado ao cálcio, sendo controlado por um sistema fisiológico eficiente envolvendo os hormônios da paratireóide (PTH), calcitonina e vitamina D (Gurtler et al., 1984). Assim, quando o nível de absorção do P não atende às exigências metabólicas, o P reciclado do osso aumenta e o excesso pode ser detectado no plasma, motivo pelo qual alguns pesquisadores consideram esta variável um indicador pouco preciso do aproveitamento do P (Vipperman Jr. et al., 1974).

O refluxo do P para o trato gastrintestinal e a urina ocorre para regular a concentração no sangue, podendo explicar a ausência de efeito no plasma, quando este é esperado. Observaram-se, neste experimento, valores de 8,43; 7,90; 7,59 e 7,44 mgP/100 mL de plasma, correspondendo, respectivamente, aos níveis 253, 759, 1265 e 1748 UF. O valor do V_aT foi de 98,52; 133,22; 111,07 e 88,00 mgP/kgPV.dia, de V_eo-, de 7,00; 3,52; 3,92 e 7,52 mgP/kgPV/dia; e de V_eT-, de 1,43; 0,60; 0,81 e 2,31 mgP/kgPV.dia, respectivamente. Portanto, o refluxo explica a ausência de efeito para a variável P no plasma, pois para os menores valores de V_aT os de refluxo foram maiores.

Observou-se efeito linear decrescente = 5,873 — 0,0964X, R² = 0,83 (P< 0,05) do P total absorvido (V_AT) sobre o refluxo do P reciclado dos ossos. À medida que o V_aT aumentou, o refluxo de P dos ossos para o trato gastrintestinal e a urina reduziu, demonstrando que, em situações de redução do P no plasma, a reabsorção pode ser superior à exigência, sendo o excesso excretado no TGI e na urina.

Lopes et al. (2001), estudando o fluxo de P em suínos alimentados com dietas contendo fosfato bicálcico, Tapira, Patos de Minas, monoamônio, supertriplo e dieta sem P inorgânico, observaram os seguintes valores: 1 — V_eo-: 6,08; 2,38; 2,55; 5,09; 4,07 e 8,42 mgP/kgPV.dia, 2 — V_eT-: 1,81; 0,62; 0,75; 1,20; 0,97 e 2,55 mgP/kgPV.dia. O refluxo de P do tratamento sem P inorgânico foi superior ao tratamento com fosfato bicálcico e fosfatos naturais, reforçando a hipótese de que a reabsorção do P pode ser maior que a exigência metabólica. Fernandez (1995) estudou níveis altos e médios de consumo de P e Ca e também observou maior refluxo nos níveis médios.

O modelo biomatemático utilizado mostrou-se eficiente em explicar o fluxo do fósforo no organismo de suínos em crescimento.

A enzima fitase interferiu no fluxo biológico do P do trato gastrintestinal para os ossos e no refluxo dos compartimentos ossos e tecidos moles para o trato gastrintestinal.

A fitase no nível de 759 UF/kg de ração disponibilizou mais eficientemente o fósforo orgânico para o metabolismo dos suínos.