Efeito antagônico de Trichoderma sp. No desenvolvimento de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. e Metar (página 2)

Efeito de Trichoderma sp. no crescimento vegetativo de B. bassiana e M. anisopliae in vitro: Os fungos entomopatogênicos B. bassiana (isolado 634) e M. anisopliae (isolado E-9) foram inoculados em meio de cultura BDA (batata-dextrose-ágar), com posterior inoculação de Trichoderma sp., em diferentes períodos de tempo decorridos após o plaqueamento dos entomopatógenos. A inoculação dos fungos foi feita por meio de uma alça de platina, sendo os entomopatógenos inoculados em 4 pontos eqüidistantes e Trichoderma sp. na região central das placas de Petri. O inóculo dos entomopatógenos foi obtido a partir de material armazenado no banco de patógenos do Laboratório de Patologia de Insetos do Departamento de Entomologia da ESALQ/USP e o de Trichoderma sp. a partir de amostras de solo inoculadas em meio seletivo Dodine (Chase et al., 1986). Os períodos entre a inoculação dos entomopatógenos e de Trichoderma sp. foram de 0, 48, 120 e 168 horas. Cada tratamento foi repetido 6 vezes (6 placas por tratamento), em delineamento inteiramente casualizado, sendo os seguintes: B. bassiana, M. anisopliae e Trichoderma (inoculados isoladamente), B. bassiana x Trichoderma e M. anisopliae x Trichoderma (inoculados conjuntamente). As avaliações foram feitas 48 e 120 horas após a inoculação de Trichoderma sp. em cada tratamento, sendo medido o diâmetro médio das colônias. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e teste de Tukey (P < 0,05) para comparação entre as médias.

Efeito de extrato tóxico de Trichoderma sp. sobre o desenvolvimento de B. bassiana e M. anisopliae: O fungo Trichoderma sp. foi produzido em meio líquido específico para a extração de toxinas (Czapeck Dox) (Alves et al., 1998). Foram colocados 50,0 ml do meio líquido em 16 frascos Erlenmeyer, nos quais foram inoculadas amostras de 0,5 cm de diâmetro, das culturas de Trichoderma sp. obtidas em placas com meio MC (meio para produção de esporos) (Alves et al., 1998). Em seguida, os frascos, tampados com algodão hidrófobo, foram transferidos para incubadora com agitação a 184 rpm e 26ºC, por um período de 10 dias. Após esse período, o material contido nos frascos foi filtrado a vácuo, utilizando-se um funil de Büchner com papel de filtro, acoplado a um compressor de ar. Ao líquido filtrado foi adicionado o solvente orgânico diclorometano, na proporção de 2:1 em volume. A mistura permaneceu em processo de decantação por 24 horas em funil de separação. Após esse período, a fração dissolvida foi levada a um Rotavapor, sendo o material resultante, após a evaporação do solvente, utilizado para a experimentação.

O extrato foi lavado em água destilada estéril em balão volumétrico, visando o aproveitamento de todo o material. Assim, o volume obtido (extrato + água destilada estéril) totalizou 9,0 ml. Esse material foi adicionado nas proporções de 0,1; 0,5; 1,0 e 5,0 ml por 100,0 ml de meio de cultura BDA, quando este ainda se encontrava liquefeito, com temperatura em torno dos 40ºC. Além desses tratamentos, foi feito um tratamento testemunha (BDA sem adição do extrato) e um tratamento branco (5,0 ml de diclorometano/100,0 ml de meio de cultura BDA), visando detectar um possível efeito do solvente sobre o desenvolvimento dos entomopatógenos. Os fungos B. bassiana e M. anisopliae foram então inoculados no meio de cultura, após a sua solidificação, em 3 pontos eqüidistantes das placas, totalizando 12 colônias (4 placas por tratamento), das quais 6 colônias foram escolhidas aleatoriamente, resultando em 6 repetições por tratamento. Após a inoculação dos entomopatógenos, as placas foram mantidas em estufas incubadoras B.O.D. a 26 ± 0,5ºC, e fotofase de 12 horas, por um período de 10 dias, quando então foram medidos os diâmetros médios das colônias. Posteriormente, as mesmas foram recortadas do meio de cultura e colocadas em tubos de vidro de 9,0 cm x 3,0 cm, nos quais foram feitas as diluições necessárias em água destilada estéril mais espalhante adesivo Tween 80, para a contagem do número de conídios produzidos por colônia, em câmara de Neubauer. Para que se procedesse a contagem, as colônias recortadas foram pinceladas para facilitar o desprendimento dos conídios e, depois, passaram por agitação em equipamento agitador de tubos, para o completo desprendimento e suspensão dos mesmos. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e teste de Tukey (P < 0,05) para a comparação entre as médias.

Efeito de Trichoderma sp. no crescimento vegetativo de B. bassiana e M. anisopliae in vitro: Quando o fungo Trichoderma sp. foi inoculado simultaneamente com B. bassiana ou M. anisopliae, observou-se, na avaliação de 48 horas após a inoculação de Trichoderma sp., que este fungo possui uma taxa muito rápida de crescimento micelial. Tanto no tratamento no qual foi inoculado isoladamente, como naqueles em que foi inoculado conjuntamente com os dois entomopatógenos, Trichoderma sp. já ocupava praticamente dois terços do espaço existente no meio de cultura, a partir da região central onde foi inoculado. Nessa avaliação ainda não havia diferenciação entre as colônias de B. bassiana inoculadas isoladamente ou em conjunto com Trichoderma sp., o mesmo acontecendo com M. anisopliae. Já na avaliação de 120 horas, ficou evidente o efeito de Trichoderma sp. sobre os entomopatógenos. As colônias de B. bassiana inoculadas isoladamente atingiram, em média, diâmetros de cerca de 16 mm, contrastando com aquelas inoculadas conjuntamente com Trichoderma sp., as quais permaneceram com o tamanho médio semelhante ao obtido na avaliação de 48 horas. O mesmo ocorreu com M. anisopliae, que na avaliação de 120 horas apresentou diâmetro médio de colônias próximo a 15 mm quando inoculado isoladamente, contra cerca de 2 mm quando inoculado conjuntamente com Trichoderma sp. (TABELA 1).

Quando a inoculação do fungo Trichoderma sp. foi realizada 48 horas após a inoculação de B. bassiana ou M. anisopliae, observou-se que Trichoderma sp., na avaliação das 48 horas, assim como no experimento anterior, já havia crescido em quase todo o espaço disponível na placa, porém, naqueles tratamentos em que B. bassiana ou M. anisopliae haviam sido inoculados anteriormente, o fungo teve seu crescimento um pouco prejudicado. Com relação a B. bassiana e M. anisopliae, notou-se que não houve diferença entre as colônias crescidas isoladamente ou na presença de Trichoderma sp. Na avaliação de 120 horas, também como ocorrido anteriormente, o fungo Trichoderma sp. dominou totalmente o espaço da placa, enquanto que B. bassiana e M. anisopliae, quando inoculados isoladamente, cresceram mais que as colônias inoculadas na presença de Trichoderma sp., as quais permaneceram com diâmetros semelhantes àqueles obtidos na avaliação de 48 horas (TABELA 2).

Com relação ao experimento em que a inoculação de Trichoderma sp. foi feita após 120 horas da inoculação de B. bassiana ou M. anisopliae, o fungo Trichoderma sp. apresentou, na avaliação de 48 horas, maior crescimento quando inoculado isoladamente que quando inoculado na presença dos entomopatógenos. B. bassiana e M. anisopliae apresentaram crescimento semelhante quando inoculados isoladamente ou na presença de Trichoderma sp. Por outro lado, na avaliação de 120 horas, mais uma vez Trichoderma sp. ocupou todo o espaço da placa, enquanto os fungos B. bassiana e M. anisopliae cresceram de forma semelhante quando inoculados isoladamente ou na presença de Trichoderma sp., mantendo os diâmetros médios observados na avaliação de 48 horas. (TABELA 3).

Quando o fungo Trichoderma sp. foi inoculado após 168 horas da inoculação de B. bassiana ou M. anisopliae, notou-se, na avaliação de 48 horas, que houve, como nos dois experimentos anteriores (48 e 120 horas), uma diminuição no crescimento de Trichoderma sp. quando inoculado na presença dos entomopatógenos, em relação ao seu crescimento isoladamente. B. bassiana e M. anisopliae tiveram, nessa avaliação, um crescimento semelhante quando inoculados isoladamente ou na presença de Trichoderma sp. Na avaliação de 120 horas, novamente já se observava o crescimento total de Trichoderma sp., sendo que não houve diferenças entre o crescimento de B. bassiana e M. anisopliae quando inoculados isoladamente ou na presença de Trichoderma sp. O dado interessante nessa avaliação, ao contrário do que havia ocorrido nas anteriores, foi o fato de que os fungos B. bassiana e M. anisopliae continuaram normalmente o seu crescimento entre as duas avaliações, tanto quando inoculados isoladamente, quanto na presença de Trichoderma sp. (TABELA 4).

De maneira geral, notou-se que o fungo Trichoderma sp. mostrou uma alta taxa de crescimento micelial, ocupando, já na primeira avaliação (48 horas da inoculação), cerca de dois terços do espaço total da placa. Nos experimentos em que a inoculação de Trichoderma sp. foi feita simultaneamente ou após 48 horas da inoculação de B. bassiana ou M. anisopliae, o efeito inibitório de Trichoderma sp. sobre os entomopatógenos foi claramente notado, comparando-se os diâmetros obtidos nas duas avaliações (48 e 120 horas). Nesses casos, observou-se que o fungo Trichoderma sp. cresceu inclusive sobre as colônias dos entomopatógenos, sem a ocorrência de halos de inibição, evidenciando seu alto poder de competição.

Nos experimentos em que a inoculação de Trichoderma sp. foi feita 120 e 168 horas após a inoculação dos entomopatógenos, o fungo Trichoderma sp., considerando-se a primeira avaliação (48 horas), teve alguma dificuldade em se estabelecer, comparando as colônias inoculadas isoladamente com aquelas inoculadas na presença de B. bassiana ou M. anisopliae. Porém, quando feita a avaliação das 120 horas, Trichoderma sp. já havia se estabelecido, e, como nos experimentos anteriores, dominou a placa em toda sua extensão. Nesses casos, observou-se a formação de halos de inibição entre as colônias de Trichoderma sp. e dos entomopatógenos, sendo que o crescimento de B. bassiana e M. anisopliae continuou ocorrendo entre as duas avaliações, principalmente no experimento em que a inoculação de Trichoderma sp. foi feita após 168 horas da inoculação dos entomopatógenos, no qual houve diferença entre o crescimento de B. bassiana e M. anisopliae nas duas avaliações, independentemente de as colônias estarem ou não na presença de Trichoderma sp. Esses halos de inibição notados entre as colônias podem ser o resultado aparente da produção de enzimas hidrolíticas extracelulares utilizadas por Trichoderma para a colonização do substrato e quebra da parede celular e citoplasmática dos competidores (Jeffries & Young, 1994). Essas enzimas, segundo De la Cruz et al. (1995), já foram caracterizadas para Trichoderma harzianum, como -1,6-glucanases extracelulares, que degradam açúcares solúveis e produzem halos hidrolíticos em paredes celulares de leveduras. No caso de fungos entomopatogênicos, os poucos relatos de micoparasitismo e/ou competição indicam que há muita semelhança entre os mecanismos utilizados pelos parasitos/competidores, como é o caso de uma substância antibiótica (fomalactona) extraída de Hirsutella thompsonii, que inibe a germinação de conídios de B. bassiana (Krasnoff & Gupta, 1994; Roberts & Krasnoff, 1998).

Os resultados obtidos no presente trabalho confirmam a capacidade competitiva de Trichoderma sp. em relação aos dois entomopatógenos, B. bassiana e M. anisopliae. Esse aspecto merece atenção, como foi referido anteriormente, em vista dos possíveis efeitos negativos quando da utilização de entomopatógenos em programas de controle microbiano de insetos, principalmente no solo, ambiente onde o fungo Trichoderma, assim como outros antagonistas, ocorre em abundância. O fato de Trichoderma sp. não afetar o desenvolvimento de B. bassiana e M. anisopliae decorridos períodos de tempo que permitam um crescimento inicial desses entomopatógenos, pode ser um indicativo da adoção de técnicas que protejam o entomopatógeno da ação imediata do antagonista, preservando seu potencial como agente de controle biológico de pragas.

Efeito de extrato de Trichoderma sp. sobre o desenvolvimento de B. bassiana e M. anisopliae. Foi possível observar, com relação a B. bassiana, que o extrato afetou o diâmetro das colônias e o número de conídios produzidos somente quando adicionado na maior concentração, ou seja, 5,0 ml de extrato/100,0 ml de meio de cultura BDA. Nas outras concentrações, que variaram de 0,1 a 1,0 ml de extrato/100,0 ml de meio de cultura, não houve qualquer efeito da adição do extrato (TABELA 5). Com relação a M. anisopliae, ocorreu o mesmo efeito, com a única diferença de que, no parâmetro diâmetro de colônias, já se notou um pequeno efeito da adição de 1,0 ml do extrato, sendo que esta concentração não diferenciou das outras inferiores, mas somente da testemunha (TABELA 6). De maneira geral, pode-se notar que a metodologia utilizada para extração foi adequada, pois o tratamento branco (adição do solvente diclorometano na proporção de 5,0 ml/100,0 ml de meio de cultura) não causou qualquer efeito negativo sobre o desenvolvimento dos dois entomopatógenos.

Krasnoff & Gupta (1994) extraíram, com o solvente diclorometano, extratos de culturas de três isolados do fungo entomopatogênico Hirsutella thompsonii var. synnematosa, que inibiram a germinação de conídios in vitro de vários outros fungos entomopatogênicos, incluindo B. bassiana, M. anisopliae e Tolypocladium sp.. Um desses extratos foi isolado e identificado como sendo o antibiótico fomalactona.

Para o estudo do efeito de metabólitos de fungos antagonistas sobre o desenvolvimento de seus hospedeiros, algumas metodologias específicas têm sido utilizadas. Camporota (1985) estudou a emissão de substâncias voláteis produzidas por Trichoderma sp. sobre o desenvolvimento de Rhizoctonia solani, por meio de um aparato que permitia a colocação de culturas dos dois fungos para crescer em ambiente hermeticamente fechado. Decorrido o período necessário ao desenvolvimento das culturas, fazia-se a mensuração do diâmetro das colônias de R. solani, determinando-se a taxa de inibição do crescimento causada por substâncias voláteis. Para a observação da inibição causada por metabólitos não-voláteis difundidos no meio de cultura, esse autor utilizou a técnica da membrana de celofane, que consiste na inoculação do fungo antagônico em meio de cultura sólido coberto por membrana de celofane, semi-permeável, a qual permite a difusão dos metabólitos não-voláteis para o meio de cultura, e, após a retirada dessa membrana, inocula-se o fungo a ser avaliado, medindo-se o seu crescimento na presença ou ausência de tais substâncias. Também Rai et al. (1980) estudaram a ocorrência de metabólitos voláteis e não-voláteis de Trichoderma sp. sobre espécies de Aspergillus. A diferença, nesse estudo, foi a utilização do meio líquido Czapeck Dox, também utilizado no presente trabalho, visando, após filtragem, adicionar o filtrado a meio de cultura sólido, na proporção de 1:4, avaliando-se o efeito dos metabólitos contidos no filtrado sobre o fungo estudado. Turhan & Grossmann (1994) também utilizaram esta técnica, mantendo colônias de diversas espécies de Myrothecium sp. em frascos com meio líquido por 15 dias, adicionando, ao final desse período, o filtrado ao meio BDA na proporção de 1:7, avaliando o crescimento de vários fungos e bactérias antagônicas. Nesses três trabalhos foram encontradas diferenças na suscetibilidade das diversas espécies dos fungos estudados quanto ao seu crescimento na presença de tais substâncias. Assim, torna-se evidente a existência de vários mecanismos pelos quais pode atuar o fungo Trichoderma sp., dependendo do microrganismo a ser antagonizado.

No presente trabalho, a utilização de um solvente orgânico ao filtrado objetivou uma melhoria na metodologia, já que a maioria das toxinas e enzimas produzidas pelo metabolismo secundário de fungos são solúveis em solvente orgânico. Isso foi feito no trabalho de Krasnoff & Gupta (1994), no isolamento da fomalactona. Com esse solvente, pretendeu-se eliminar outras possíveis substâncias presentes no filtrado que pudessem mascarar o efeito do extrato tóxico. Outro fato a ser comparado, é a diluição à qual foram submetidos os diferentes filtrados aqui analisados. As proporções de 1:4 ou 1:7, utilizadas nos trabalhos anteriores, referem-se ao filtrado, misturado aos componentes do meio líquido, dos quais destaca-se a grande quantidade de água. No presente estudo, a fração tóxica extraída com a evaporação do solvente, teoricamente, estaria mais concentrada que o filtrado completo, porém, utilizou-se pequena quantidade de água na retirada do material do frasco de vidro utilizado no evaporador. Assim, também não se pode garantir a pureza absoluta desse material. Uma etapa a mais seria o isolamento e caracterização de uma possível toxina. Isso já foi feito, no trabalho de Krasnoff e Gupta (1994), e já existem padrões comparativos para tal.

Quanto à ação de Trichoderma sp. sobre B. bassiana e M. anisopliae, pode-se inferir que há um efeito da combinação dos diferentes modos de ação de Trichoderma sp., já que, no item anterior, verificou-se a ação no antagonismo direto, ou seja, utilizando o espaço disponível no ambiente, competindo por nutrientes através da alta taxa de crescimento micelial. Esse fato, aliado à ação também detectada de metabólitos não-voláteis, pode explicar a vantagem competitiva de Trichoderma. Seria interessante o complemento desse estudo para a verificação de metabólitos voláteis, por meio das técnicas já citadas, e também da tentativa de observação de micoparasitismo através de técnicas mais apuradas, como a microscopia eletrônica de varredura (Inbar et al., 1996) ou mesmo a microscopia de fluorescência (Barak & Chet, 1986).

- O fungo Trichoderma sp. afeta o desenvolvimento de B. bassiana e M. anisopliae, inibindo o crescimento micelial dos entomopatógenos, quando inoculado simultaneamente ou 48 horas após a inoculação dos fungos entomopatogênicos.

- B. bassiana e M. anisopliae desenvolvem-se normalmente quando inoculados num intervalo de 168 horas antes da inoculação de Trichoderma sp..

- O extrato de Trichoderma sp. altera o crescimento micelial e a conidiogênese de B. bassiana quando adicionado na concentração de 5,0 ml de extrato/100,0 ml de meio de cultura, sendo que para M. anisopliae o extrato começa a atuar na concentração de 1,0 ml de extrato/100,0 ml de meio de cultura.