Caracterização molecular de cultivares de pessegueiro e nectarineira com microssatélites (página 2)

Até meados da década de 60, a diferenciação de genótipos nos estudos de genética e melhoramento estava associada às características morfofenológicas das plantas. Porém, este método de análise tem como limitações as influências ambientais sobre o fenótipo, além do gasto excessivo de tempo e dinheiro (Sansavini, 1998). Dentro do gênero Prunus, o pessegueiro e a nectarineira pertencem à espécie de menor variabilidade genética, possuindo baixo polimorfismo das características morfofenológicas (Vinatzer et al., 1999) de tal maneira que, muitas vezes, a identificação entre cultivares baseada somente no fenótipo deixa muitas dúvidas quanto à verdadeira identidade dos genótipos (Pancaldi et al.,1999). Buscando superar este fator limitante, novos métodos de análise foram sendo introduzidos em auxílio à caracterização genética de cultivares. Inicialmente, a análise isoenzimática tem sido empregada para identificação de cultivares (Pancaldi & Battistini, 1991); entretanto, esta técnica não fornece polimorfismo suficiente para uma caracterização detalhada de genótipos de baixa variabilidade, como é o caso do pessegueiro, não permitindo a individualização, mas somente a separação em grupos (Arulsekar & Parfitt, 1986; Lima, 2001). Porém, quando se utilizam marcadores moleculares, a possibilidade de identificação de genótipos aumenta consideravelmente em todas as espécies frutícolas (Mulcahy et al., 1993), nas quais a combinação de poucos marcadores são suficientes para diferenciá-las, produzindo um tipo de impressão digital molecular da planta, também conhecida como fingenprinting varietal, a qual é obtida a partir da análise do DNA das mesmas (Sansavini, 1998).Entre os marcadores moleculares disponíveis atualmente para análise genética, os microssatélites ou SSR representam regiões de DNA de seqüência repetida em número variável. Os microssatélites apresentam como vantagens o carácter co-dominante, elevado polimorfismo e alta reprodutibilidade, características importantes para análise baseada em marcadores moleculares (Sansavini, 1998; Sosinski et al., 2000).

Garantias de idoneidade genética do material vegetal é um atributo qualitativo de grande importância para o setor viveirístico e frutícola, para a formação de pomares de qualidade. Portanto, o objetivo deste trabalho foi verificar a viabilidade de utilização dos marcadores microssatélites na caracterização de um grupo de cultivares de pessegueiro e de nectarineira de importância econômica no Brasil.

No presente estudo, foram analisados 36 genótipos de Prunus persica, sendo 8 cultivares de nectarineira, 14 cultivares de pessegueiro para consumo in natura, 4 de dupla finalidade e 10 do tipo indústria (Tabela 1).

As análises moleculares foram realizadas nos Laboratórios de Biologia Molecular, da Universitá Degli Studi di Bologna — Itália, e no de Cultura de Tecidos Vegetais, do Departamento de Botânica da Universidade Federal de Pelotas, Pelotas-RS. As análises foram repetidas em ambos os laboratórios a partir de DNA extraído de folhas coletadas de duas plantas diferentes.

O material vegetal utilizado nas análises foi obtido na Embrapa Clima Temperado, Pelotas-RS e no Viveiro Quinta Marli, Pelotas-RS. Para as análises, a extração do DNA foi realizada utilizando amostras com 50 mg de folhas liofilizadas, conforme metodologia descrita por Mulcahy et al. (1993) e com modificações conforme Bianchi et al. (2002); o DNA obtido foi diluído em TE pH 8,0 e, após tratamento com RNAse, foi quantificado com fluorímetro (Hoefer Instrument, TK100 Model) e diluído com água estéril para a concentração final de 20 ng.µL^-1, para ser utilizado na Reação da Polimerização em Cadeia (PCR).

Os primers microssatélites utilizados foram o UDP96-001, UDP96-003, UDP96-005, UDP96-008, UDP96-013, UDP96-018, UDP96-019, UDP97-402, UDP98-022, UDP98-024, UDP98-407, UDP98-412 e UDP98-414, cujas seqüências são descritas por Cipriani et al. (1999). As reações de PCR foram conduzidas em aparelho termociclador "MJ PTC-100" em volume de 25 µL contendo 10 mmol.L^-1 Tris-HCl pH 9,0; 50 mmol.L^-1 KCl, 1,5 mmol.L^-1 MgCl₂; 0,2 mmol.L^-1 de cada dNTP; 0,2 mmol.L^-1 de cada primer; 0,1 Unidades de Taq polimerase (Amersham Pharmacia Biotech); 50 ng de DNA genômico e, ao final, adicionou-se uma gota de óleo mineral. O perfil térmico utilizado foi um ciclo a 95°C por 5 min, 35 ciclos a 94°C por 45 s; 57°C por 45 s e 72°C por 45 s, seguindo-se de um ciclo final a 72°C por 8 min.

Aos produtos da reação de PCR foram adicionados 10 µL de solução desnaturante (98% formamida, 10 mmol.L^-1 EDTA, 0,05% azul de bromofenol e 0,05% xyleno cyanol), seguido de tratamento térmico a 95°C por 5 minutos. Uma aliquota de 4,5 µL de cada amostra amplificada foi aplicada ao gel. A eletroforese foi conduzida em gel de poliacrilamida a 6%, em tampão 1X TBE a 7 V.cm^-1, pelo período de 2 horas e 30 minutos. A coloração do gel foi realizada utilizando nitrato de prata, segundo a metodologia descrita no Manual Promega "Silver Sequencing" (Promega, Madison, Wisconsin, USA).

Os produtos da amplificação visualizados no gel, produzidos por cada primer, foram utilizados na elaboração de uma matriz de similaridade genética, por meio do registro da presença (1) e da ausência (0) de bandas no perfil eletroforético de cada genótipo, e serviu para a diferenciação das cultivares. A similaridade genética foi calculada usando-se o coeficiente de Dice e, para visualizar a forma de agrupamento das cultivares, foi elaborado o dendrograma empregando-se o método UPGMA (Unweighted pair group mean average), utilizando o software NTSYS.pc versão 2.1 (Rohlf, 2000).

O número de alelos amplificados com cada primer variou de três com UDP96-019, UDP97-402 e UDP98-022 até sete com UDP98-414, enquanto o número de bandas amplificadas variou de uma a três por genótipo (Figura 1A e 1B).

Os 13 primers utilizados amplificaram um total de 56 alelos, dos quais 55 (98,2%) foram polimórficos e permitiram a diferenciação de 32 genótipos dos 36 analisados. Somente UDP98-022 apresentou uma banda monomórfica para as cultivares testadas. Este resultado deve-se, principalmente, à presença de cultivares pertencentes ao grupo indústria, dupla finalidade e consumo in natura, o qual contribui para aumentar a proporção de alelos distintos.

Com a repetição das análises em dois laboratórios distintos, verificou-se que genótipos iguais, porém, de diferente procedência, apresentaram perfis eletroforéticos iguais, confirmando a confiabilidade da técnica, também verificada na análise genética de diferentes espécies do gênero Prunus (Pancaldi et al.,1999; Bianchi et al., 2002). Essa confiabilidade e o poder da técnica SSR foi também demonstrada por Sosinski et al. (2000) na diferenciação de pessegueiros da cv. Springcrest, nos quais os microssatélites detectaram variabilidade entre plantas da mesma cultivar, porém originadas de três fontes diferentes.

Das 8 nectarineiras analisadas, 4 ficaram no mesmo grupo da cultivar de pessegueiro Charme (Figura 2). As cultivares de nectarineira Armking e Sunlite, Anita e Dulce formaram dois grupos distintos, porém sempre relacionados com cultivares de pessegueiro para consumo in natura. A similaridade genética estimada para 'Dulce' e 'Anita' com os microssatélites foi de 0,82 (Figura 2), sendo maior do que aquela obtida por Lima (2001) através do polimorfismo do DNA amplificado ao acaso ou RAPD (0,75). Para as cultivares Coral e Marfim, a similaridade estimada por RAPD foi de 0,87 (Lima, 2001), e de 0,85 com os microssatélites, revelando boa concordância entre os dados gerados por ambos os marcadores e os dados genealógicos destas cultivares (Tabela 1).

Dentre os pessegueiros para consumo in natura, os maiores valores de similaridade foram verificadas entre as cvs. Coral e Planalto (0,94) e Della Nona e Marfim (0,90) (Figura 2). Isto se deve à constituição genética das 4 cultivares, já que 'Coral' e 'Della Nona' possuem como ancestral comum a cv. Delicioso, enquanto 'Planalto' e 'Marfim' têm em comum a cv. Coral (Tabela 1). Esta mesma comparação pode ser feita entre as cvs. Marli e Chiripá, que possuem em comum a cv. Delicioso e estão agrupadas mais próximas de 'Marfim' e 'Della Nona', o que pode ser atribuído ao fato de 'Della Nona' e 'Chiripá' possuírem como genitor comum a cv. Nectared 5 (Tabela 1).

Obteve-se uma clara separação dos pessegueiros tipo indústria. Os de dupla finalidade formaram um grupo separado, porém mais próximo do tipo indústria, com exceção da cv. Eldorado (Figura 2). Neste caso, também se observa uma estreita relação entre os dados moleculares e os genealógicos (Tabela 1) de 'Riograndense' e 'Leonense' com similarididade estimada em 0,83 (Figura 2), ambos com origem das cvs. Brilhante e NJC97.

De acordo com os dados da Tabela 1, existe um estreito grau de parentesco entre as cultivares Precocinho e Diamante. Neste trabalho, não foi possível a diferenciação destas duas cultivares, possivelmente em função do número de primers e do alto grau de parentesco. A análise com um maior número de primers microssatélites, possivelmente, poderá diferenciar estas duas cultivares, pois, de acordo com análise RAPD realizada por LIMA (2001), foi possível diferenciar estes dois genótipos, confirmando que não se trata da mesma cultivar. Para 'Pialo' e 'Saco de Touro', a análise com 13 primers SSR produziram perfis eletroforéticos idênticos. Neste caso, análises com maior número de primers e uma nova avaliação das características morfofenológicas das plantas se fazem necessárias, além da utilização de outras técnicas moleculares como RAPD e polimorfismo no comprimento dos fragmentos amplificados ou AFLP, a fim de verificar se esse é um caso de sinonímia.

De modo geral, um grande número de polimorfismo foi gerado pelos marcadores microssatélites utilizados, principalmente por UDP98-414, UDP96-005, UPD96-003. Verificou-se que a técnica apresenta vantagens quando comparada aos RAPD e isoenzimas, devido ao maior número de polimorfismo e repetibilidade dos resultados. Além disso, possui alta aplicabilidade entre espécies correlaciondas, conforme verificado por Pancaldi et al. (1999) e por Cipriani et al. (1999), em várias espécies de Prunus spp..

1) A técnica baseada em marcadores de microssatélites produz elevado polimorfismo entre cultivares de pessegueiro.

2) Marcadores de microssatélites podem ser utilizados na certificação da idoneidade genética de plantas de pessegueiro e nectarineira cultivadas no Brasil.

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