Avaliação de fungos entomopatogênicos para o controle de Tetranychus urticae Koch (página 2)

Tetranychus urticae Koch (Acari: Tetranychidae) apresenta grande capacidade de desenvolvimento de resistência à acaricidas químicos, sendo considerado uma das principais pragas das culturas hortícolas em todo mundo (JEPPSON et al., 1975; CRANHAM & HELLE, 1985). Seus inimigos naturais incluem diversos grupos de artrópodos (insetos e ácaros predadores) e os entomopatógenos.

As pesquisas conduzidas com entomopatógenos concentram-se em dois grupos de fungos. O primeiro é representado por espécies da Ordem Entomophthorales, conhecidas por causarem epizootias em populações de diversas espécies de ácaros da família Tetranychidae. Apesar de sua reconhecida importância, seu potencial como agente de controle tem sido pouco explorado em razão das dificuldade que ainda envolvem sua produção.

Esta situação limita a utilização destes fungos à estratégias que preconizam sua proteção no agroecossistema e introdução em áreas onde ainda não ocorrem (controle biológico clássico), como é feito para algumas espécies desta Ordem que infectam insetos (LACEY et al., 2001). No segundo grupo estão os fungos imperfeitos (Deuteromycotina: Hyphomycetes) de amplo espectro hospedeiro e de fácil produção em meios de cultura, como Beauveria bassiana (Bals.) Vuill., Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin, Verticillium lecanii (Zimm.) Viègas e Hirsutella thompsonii Fischer. Esses fungos são de ocorrência comum e podem ser facilmente isolados de amostras de solo e de insetos e/ou ácaros infectados, sendo predominantes nas principais coleções de fungos entomopatogênicos no Brasil (ESALQ/USP e Instituto Biológico) (ALMEIDA & BATISTA FILHO, 2001).

A variabilidade genética dos isolados nessas coleções já foi comprovada, principalmente, quanto aos padrões moleculares e patogenicidade à insetos e ácaros pragas (ALMEIDA et al., 1997; LOPES, 1999; NEVES & ALVES, 2000; ALVES et al., 2001; RAMOS, 2001), constituindo-se desta maneira em reservatórios diversificados para estudos visando a seleção de materiais que apresentem características adequadas para sua utilização em programas de controle biológico de pragas. Estas características são definidas de acordo com a estratégia de uso do entomopatógenos, em que se considera a bioecologia da praga alvo e as características da cultura e do ambiente em que a praga encontra-se.

A estratégia mais comum de uso de fungos entomopatogênicos no controle de pragas é a introdução inundativa, na qual se utilizam grandes quantidades do entomopatógeno para uma rápida supressão da população (LACEY et al., 2001). Esta situação é adequada em tratando-se de pragas como T. urticae que apresenta grande capacidade biótica, ciclo de vida curto e que ocorre em culturas cujos níveis de dano são muito reduzidos, como nas culturas de ornamentais e olerícolas. Para esta estratégia, o entomopatógeno precisa ser efetivo no controle da praga, de fácil produção e armazenamento. Desse modo, o objetivo desta pesquisa foi o de avaliar a patogenicidade de 45 isolados de cinco espécies de fungos Hyphomycetes ao ácaro T. urticae, com a finalidade de selecionar isolados promissores para uso no controle da praga.

Fêmeas adultas recém emergidas de T. urticae foram transferidas de uma criação estoque em plantas de feijão-de-porco, Canavalia ensiformis (Dicotiledonea: Fabaceae), para placas de pelietireno de 4,0 cm de diâmetro, contendo cada placa um disco de folha de C. ensiformis de 2,5 cm de diâmetro sobre uma espuma de polietileno umedecida. Cada placa recebeu inicialmente 15 fêmeas do ácaro, sendo após trinta minutos retirados os ácaros mortos e o excedente, mantendose apenas 10 ácaros/placa. Em seguida, os ácaros foram pulverizados com suspensões de conídios em Torre de Potter, utilizando-se volume de 2 mL de suspensão 1,7 x 107 (Hirsutella sp.) ou 5 x 107 conídios/ mL (Aschersonia aleyrodis, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae e Paecilomyces farinosus) e pressão de 15 libras/pol2. Foram avaliados 45 isolados destas espécies de fungos entomopatogênicos. Cada isolado (tratamento) foi aplicado em 10 placas, sendo cada placa uma repetição. Após a pulverização, as placas foram mantidas em condição ambiente por 15 minutos para a evaporação da porção líquida da suspensão. Posteriormente, foram acondicionadas dentro de caixa plástica transparente (34 cm de comprimento x 22 cm de largura e 12 cm de altura). A caixa foi mantida fechada dentro de câmara para B.O.D., sob a temperatura de 25 ± 1°C, 98% de UR e 12 horas de fotofase. Diariamente a caixa foi mantida aberta por 30 minutos para a renovação do ar com o ambiente.

As avaliações foram realizadas uma vez ao dia, anotando-se as mortalidades diárias (total, confirmada e corrigida) em cada placa, além da porcentagem de ácaros mortos contendo cristais de cálcio no seu interior. A mortalidade corrigida foi calculada pela fórmula de ABBOTT (1925), a partir da mortalidade total, enquanto que a mortalidade confirmada correspondeu a porcentagem de ácaros mortos que esporularam de cada tratamento [(no ácaros mortos esporulados x 100) (no ácaros mortos total)]. Amostras de 10 a 20 ácaros mortos foram montados em lâmina contendo uma mistura de Hoyer + Azul láctico (1:1) para a visualização dos cristais de cálcio em microscópio de contraste de fase. Para a confirmação da morte pelo patógeno, os ácaros mortos foram lavados em álcool 70% e posteriormente colocados em câmara úmida. A câmara úmida consistiu em uma caixa plástica hermética, com espuma umedecida no fundo.

Os isolados dos fungos entomopatogênicos avaliados (Tabela 1) encontram-se armazenados no Banco de Microrganismos Entomopatogênicos do Laboratório de Controle Biológico do Centro Experimental Central do Instituto Biológico (IB/Campinas, SP) e também no Banco de Patógenos do Laboratório de Patologia e Controle Microbiano de Insetos do Departamento de Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola da ESALQ/USP, em freezer a -12° C na forma de conídios puros. Por ocasião dos testes, os isolados foram inoculados em meio de cultura M.C. (meio completo) (ALVES et al., 1998) e mantidos por 7 dias em câmara B.O.D. a 26 ± 0,5° C e 12 horas de fotofase para o crescimento e produção de conídios. Os conídios produzidos foram removidos da superfície do meio de cultura com auxílio de uma espátula de metal, para o preparo das suspensões em água destilada estéril mais espalhante adesivo (Tween 80®- 0,2 mL/L).

Os isolados dos fungos A. aleyrodis e P. farinosus apresentaram valores de mortalidade corrigida ao quinto dia inferiores a 3%. Apesar dessa baixa patogenicidade a T. urticae, comprovou-se a sua colonização e esporulação sobre os cadáveres do ácaro (Tabela 2). A reduzida patogenicidade de A. aleyrodis a T. urticae pode ser explicada, em parte, pelo fato desta espécie de fungo possuir seu espectro hospedeiro composto predominantemente por cochonilhas, pulgões e moscas brancas (Hemiptera: Sternorrhyncha) (ALVES, 1998; SAMSON et al., 1988). O mesmo não se aplica a P. farinosus que apresenta um espectro hospedeiro mais amplo quando comparado com A. aleyrodis, distribuídos entre espécies de lepidópteros, coleópteros, himenópteros e homopteros (BOUCIAS & PENDLAND, 1998). No caso deste fungo outros fatores estão envolvidos. É importante considerar que o número de isolados avaliados destes fungos foi muito reduzido, não podendo generalizar estes resultados para toda a espécie.

Todos os isolados das espécies Beauveria spp., M. anisopliae e Hirsutella sp. foram patogênicos a T. urticae, com valores de mortalidade corrigida aumentando progressivamente com o tempo após a inoculação.

Não houve mortalidade de ácaros na avaliação realizada 24 horas após a inoculação. Ao segundo dia, a mortalidade média corrigida foi inferior a 5% nos tratamentos. Os valores tornaram-se maiores a partir do terceiro dia, sendo o acme de mortalidade observado ao quarto e quinto dias após a inoculação pelos isolados (Tabela 2).

O comportamento médio dos isolados de B. bassiana, M. anisopliae e Hirsutella sp. foram muito semelhantes para a porcentagem de mortalidade corrigida e confirmada. Ao terceiro dia, a mortalidade média corrigida foi inferior a 24%, ao quarto dia entre 50 e 60% e ao quinto dia entre 70 e 80%. Os valores médios da mortalidade confirmada entre o terceiro e quinto dia foram sempre superiores a 80%, comprovando que os ácaros mortos, em quase sua totalidade, tiveram como causa de sua morte a infecção pelo entomopatógeno. O fato de alguns ácaros não apresentarem a esporulação do entomopatógeno não descarta totalmente a possibilidade de terem sido mortos pelo inimigo natural. Em alguns casos, o álcool utilizado na desinfestação externa pode ter inviabilizado o fungo após sua entrada para o interior do cadáver por eventuais fissuras no tegumento, provocadas pelo pincel durante a transferência destes cadáveres para à câmara úmida. A ação rápida de bactérias decompositoras no cadáver pode também impedir que o fungo esporule sobre ele.

Houve variações entre os isolados dos fungos B. bassiana e M. anisopliae quanto à porcentagem de mortalidade corrigida em todos os dias de avaliação.

Grandes variações ocorreram ao terceiro dia após a inoculação, com valores entre 1 e 36%. Apenas dois isolados de B. bassiana não apresentaram valores de mortalidade (CB 4 e CB 66) neste dia de avaliação.

Estes dois isolados juntamente com CB 87 apresentaram valores inferiores a 40% decorridos cinco dias da inoculação, os menores entre todos os isolados deste entomopatógeno.

Considerando a mortalidade corrigida ao quinto dia para B. bassiana, 19 isolados (59%) apresentaram valores entre 60 a 80%, enquanto que cinco (16%) e oito isolados (25%) tiveram valores inferiores e superiores a esta faixa de mortalidade, respectivamente. Os oito isolados com maiores valores de mortalidade foram: CB 2, CB 13, CB 75, CB 146, CB 154, CB 157, CB 161 e CB 166. Quanto a M. anisopliae, a grande maioria dos isolados (80%) apresentou valores superiores a 80%, destes, apenas 4 isolados (CB 348, 1247, 1286 e PL47) apresentaram valores superiores a 90% neste dia de avaliação. O isolado 1282 de Hirsutella sp. apresentou mortalidade de 73%, um pouco inferior aos melhores isolados de B. bassiana e M. anisopliae, contudo, esse resultado é referente a concentração de 1,7 x 107 conídios/mL, concentração cerca de 3 vezes menor do que a utilizada para todas as demais espécies de fungos. O reduzido rendimento na produção de conídios em meio de cultura sólido impediu que Hirsutella sp. fosse avaliada na mesma concentração dos demais fungos.

Não houve relação aparente entre os valores de mortalidade corrigida ao terceiro dia e os observados ao quinto dia. Alguns isolados como o CB 146 e CB 154 (B. bassiana) apresentaram valores de mortalidade reduzidos ao terceiro dia (< 3%) e elevados ao quinto dia (> 80%). O inverso também foi observado, como por exemplo para o CB 141 e 147 (B. bassiana) que apresentaram valores superiores a 29% ao terceiro dia e inferiores a 70% ao quinto dia.

Os valores elevados de mortalidade ao terceiro dia indicam uma ação rápida do patógeno sobre a praga, porém a utilização deste fator como parâmetro de seleção de isolados requer algumas considerações.

Para insetos capazes de transmitir viroses e com grande capacidade de dispersão, como os tripes e moscas-brancas, torna-se necessário seu controle de forma imediata como meio de impedir o alastramento da doença na cultura. Embora T. urticae não seja um transmissor de viroses, sua ocorrência em culturas de ciclo curto e que apresentam reduzido nível de dano econômico, como as culturas ornamentais e olerícolas, exige o seu rápido controle.

A rapidez com que o patógeno mata seu hospedeiro é uma característica desejável para o controle de muitas pragas agrícolas, contudo, não deve ser considerada como única. É imprescindível também que o isolado seja capaz de proporcionar elevada mortalidade final, exigindo desta maneira pulverizações menos freqüentes e possibilitando reduzir os custos de controle das pragas.

Com exceção de Hirsutella sp., as demais espécies de fungos testados não são observadas atacando ácaros fitófagos em condições naturais, o que de certa forma explica o baixo desempenho obtido por A. aleyrodis, como referido anteriormente. Com relação à B. bassiana e M. anisopliae embora não sejam observadas causando epizootias em ácaros fitófagos, o que facilitaria sua constatação em condições naturais, estes são referidos como entomopatógenos de amplo espectro hospedeiro ou pouco específicos, causando doença em espécies de insetos e ácaros de diversas ordens e famílias.

Somente para o gênero Beauveria são conhecidas, pelo menos, 200 espécies de insetos e ácaros suscetíveis (ALVES, 1998). Esta característica tem contribuído para que estas espécies sejam muito estudadas em vista ao controle de pragas em todo mundo. Ao contrário de B. bassiana e M. anisopliae, os fungos da Ordem Entomophthorales apresentam, muitas vezes, especificidade hospedeira (DELALIBERA JÚNIOR et al., 1997). Esta característica confere aos fungos Entomophthorales uma grande segurança em termos de efeito sobre organismos não alvos, muito importante quando se deseja introduzir o inimigo natural em áreas onde não ocorre naturalmente (controle biológico clássico).

Embora muitos isolados de M. anisopliae e B. bassiana tenham se mostrado semelhantes quanto à mortalidade ao quinto dia após a inoculação, pode-se, por efeito prático, selecionar cinco isolados de cada espécie (B. bassiana: CB 2, CB 146, CB 157, CB 161 e CB 166; M. anisopliae: CB 345, CB 348, 1247, 1286 e PL47) promissores para seu desenvolvimento como constituintes de formulações micoacaricidas.

Observou-se a presença de cristais de cálcio no interior dos ácaros mortos para todos os isolados de B. bassiana (32 isolados) e M. anisopliae (10 isolados) avaliados, com ocorrências média sempre superior a 80% dos ácaros mortos observados. Para os fungos A. aleyrodis, Hirsutella sp. e P. farinosus não foi constatada a presença dos cristais em nenhum ácaro morto. Os fatores ligados a formação destes cristais nos ácaros ainda não são conhecidos, mas sua presença no interior dos ácaros mortos por B. bassiana e M. anisopliae sugerem semelhanças entre estes fungos no processo de colonização dos organismos hospedeiros.

Tabela 1
Hospedeiros e procedências dos 45 isolados de fungos entomopatogênicos utilizados nos bioensaios de seleção com Tetranychus urticae