Amostras de sangue de 470 vacas da raça Gir, filhas de 99 touros e criadas em dois rebanhos do Estado de Minas Gerais, foram coletadas e enviadas para o Laboratório de Genética Molecular da Embrapa Gado de Leite para extração de DNA e genotipagem para o loco BoLA-DRB3.2.

O DNA foi extraído a partir das células brancas das amostras de sangue, utilizando protocolo contendo tampão salino e proteinase K, sendo as proteínas removidas com fenol/clorofórmio. As amostras de DNA foram analisadas em espectrofotômetro visando determinar a quantidade e qualidade.

A amplificação do loco BoLA-DRB3.2 foi realizada utilizando a técnica de Nested PCR, conforme descrito por van Eijk et al. (1992). Para a primeira amplificação, foram utilizados os primers HLO30 (5-ATCCTCTCTCTGCAGCACATTTCC-3´) e HLO31 (5´-TTAAATTCGCGCTCACCTCGCCGC T-3´). Para a segunda amplificação, foram utilizados os primers HLO30 e HLO32 (5´-TCGCCGCTGCCACAGT-3´), visando aumentar a especificidade da reação de PCR e diminuir a presença de heteroduplexes. O primer HLO32 consiste inteiramente de nucleotídeos da extremidade 3' do exon 2 e tem oito nucleotídeos sobrepostos com a extremidade 3' do primer HLO31.

A primeira reação de PCR consistia de 10 ciclos de 94ºC por 60seg, 60ºC por 120seg e 72ºC por 60seg. Foram utilizados 12,5ng de DNA para a reação de PCR contendo uma unidade de Taq polimerase; 100µM de dNTPs; 0,2µM de cada primer; 10mM de Tris-HCl (pH 8,0); 2,5mM de MgCl₂ e 50mM de KCl. A segunda reação consistia de 30 ciclos de 94ºC por 60seg, 65ºC por 30seg, utilizando-se 1,4µl da primeira reação de PCR, num volume final de 35µl, contendo uma unidade de Taq polimerase; 100µM de dNTPs; 0,2µM de cada primer; 10mM de Tris-HCl (pH 8,0); 2,5mM de MgCl₂ e 50mM de KCl. As reações foram realizadas no termociclador GeneAmp PCR System 9600 da Applied Biosystems.

Os produtos gerados na segunda reação de PCR foram visualizados em géis de poliacrilamida nativo a 5% (500 volts por 1h), para padronizar a quantidade de material amplificado e detectar possíveis falhas de amplificação. Para isso, foram utilizados 5µl do volume final da reação. Após essa etapa, 10µl da segunda reação de PCR foram digeridos por duas horas a 37°C, separadamente, com cinco unidades das enzimas Rsa I e Hae III, e por 2h a 60ºC para a enzima Bsty I, num volume final de 15µl. Após digestão, as enzimas foram inativadas por 15min a 80ºC. Em seguida, os fragmentos foram submetidos a eletroforese vertical em géis de poliacrilamida nativo a 12% (800 volts por 3h), utilizando placas com 35cm de altura para garantir uma perfeita separação dos fragmentos. Os géis foram corados com nitrato de prata e os fragmentos foram detectados com o auxílio de padrões de 25 e 10pb. A nomenclatura dos fragmentos foi realizada conforme descrito por van Eijk et al. (1992), International... (1992) e Maillard et al. (1999).

As freqüências dos alelos do loco BoLA-DRB3.2 para as 470 vacas foram calculadas por meio de contagem direta.

Conforme proposto por Israel e Weller (1998), o modelo [1] incluiu os efeitos de gene candidato, como a seguir:

em que , e A^-1 é a inversa da matriz dos numeradores dos coeficientes de parentesco de Wrigth.

No modelo [1], os números de linhas e de colunas na matriz Q são iguais aos números de animais e de genótipos BoLA, respectivamente. Os elementos das linhas da matriz Q são iguais à unidade quando o animal apresentar o genótipo correspondente à coluna e iguais a zero, para os outros elementos.

Os efeitos de um gene sobre características quantitativas podem ser confundidos com efeitos genéticos não-aleatórios em virtude do parentesco entre indivíduos compartilhando determinado alelo. Dessa forma, para estimar o efeito direto de cada alelo, os registros de produção de leite em até 305 dias também foram analisados por meio de um modelo de substituição gênica, o qual considera o efeito aditivo de um alelo no gene BoLA. Tal modelo pode ser representado matricialmente, como:

em que m = vetor incluindo os efeitos fixos de substituição gênica para diferentes alelos BoLA representados por coeficientes de regressão e M = matriz contendo 0, 1 ou 2, representando o número de cópias de determinado alelo BoLA presente em cada indivíduo. O modelo de substituição gênica expressa o efeito de um alelo particular após a remoção dos efeitos aditivos de outros alelos portados por outros animais. O modelo [2] também foi utilizado para análise conjunta dos genótipos considerando possíveis interações epistáticas.

Todas as análises foram realizadas por meio do PROC MIXED do sistema SAS (User's..., 2000), resultando em maior flexibilidade na modelagem não somente das médias, mas também das (co)variâncias.

O produto de amplificação da segunda reação de PCR gerou fragmentos de 284pb ou 281pb, quando o animal possuía a deleção de 3pb, como descrito por van Eijk et al. (1992). Os produtos de amplificação apresentaram pouca quantidade de heteroduplexes, possibilitando a realização da etapa de digestão dos fragmentos, sem o comprometimento da identificação dos alelos. A utilização de placas com 35cm para separação eletroforética dos fragmentos permitiu a detecção dos diversos padrões de corte gerados pelas três enzimas de restrição (Fig. 1). Para a enzima RsaI, foram encontrados 18 padrões de corte do total de 25 descritos por van Eijk et al. (1992). Para a enzima BstYI, todos os padrões descritos foram encontrados. Para a enzima HaeIII, foram encontrados cinco padrões de corte do total de nove descritos pelo autor.

Com a combinação dos diferentes padrões de corte das três enzimas, 54 alelos diferentes podem ser detectados, segundo van Eijk et al. (1992). Desse total, 27 alelos foram identificados nas duas populações.

O grande número de alelos (27) identificados nos dois rebanhos demonstra que a raça Gir apresenta um alto polimorfismo para o loco BoLA-DRB3.2 (Tab. 1). No trabalho de Mota et al. (2002), o primeiro estudo a respeito do loco BoLA-DRB3.2 nessa raça, foram observados 17 alelos diferentes, sendo alguns deles já encontrados na raça Brahman por Maillard et al. (1999). Neste estudo, foram identificados sete alelos (BoLA-DRB3.2*4, *8, *11, *19, *28, *41 e *48) que não haviam sido citados em zebuínos.

Na Tab. 1 verifica-se que as freqüências alélicas variaram de 0,10 a 16,90 e a soma das freqüências dos seis alelos mais comuns (BoLA-DRB3.2*7, *16, *20, *27, *29 e *35) foi de 64,6%. Altos graus de polimorfismo também foram encontrados por Sharif et al. (1998b), na raça Holandesa, e por Gilliespie et al. (1999), na raça Jersey. Dietz et al. (1997) relataram que os locos BoLA-DRB3*8, *11,*16, *22, *23 e *24 computavam 70,3% da freqüência total, em animais da raça Holandesa, entretanto, Gilliespie et al. (1999) observaram que a soma das freqüências dos locos BoLA-DRB3*8, *10, *15, *21, *36 e *ibe foi de 73,9%. Comparando-se esses resultados, pode-se inferir que à exceção do loco *8, encontrado nas raças citadas, há grandes diferenças entre elas no que se refere à presença e/ou à freqüência dos alelos.

No rebanho A foram observados 15 diferentes alelos em 150 vacas, enquanto no rebanho B, cuja população avaliada era composta por 320 vacas, a diversidade foi maior, sendo observados 26 alelos, o que pode ser explicado pelo tamanho da amostra. Dos 15 alelos presentes na população A, apenas um alelo (*23) não estava presente na população B provavelmente atribuído à população fundadora. Na Tab. 1 verifica-se que 14 alelos foram comuns aos dois rebanhos e, dentre esses, destacaram-se os alelos *16 e *27, encontrados em altas freqüências nos dois rebanhos.

O alelo mais freqüente na população total foi o BoLA-DRB3*20. Resultado semelhante foi encontrado por Mota et al. (2004), também na raça Gir, ao investigarem as freqüências alélicas do loco BoLA-DRB3, por meio da técnica de seqüenciamento direto de produtos de PCR, em amostras de sangue obtidas de 28 vacas de outra população. Esses autores verificaram que o alelo mais freqüente foi o BoLA-DRB3*3601, cujo padrão correspondente obtido por PCR-RFLP é o BoLA-DRB3*20.

Mota et al. (2002) observaram alta freqüência do alelo BoLA-DRB3*2101, o qual corresponde ao alelo BoLA-DRB3*35, também muito encontrado em ambos os rebanhos analisados.

Em raças européias especializadas para produção de leite, Sharif et al. (1998b), na raça Holandesa, e Gilliespie et al. (1999), na raça Jersey, observaram maiores freqüências dos alelos *8 e *10, respectivamente, enquanto Takeshima et al. (2001), em animais frísios, observaram que o alelo *22 foi o de maior freqüência.

De maneira geral, pode-se verificar que, em bovinos, as interpretações dos resultados obtidos por meio das técnicas de PCR-RFLP e de seqüenciamento indicam que há diferenças significativas nas freqüências alélicas do loco BoLA-DRB3.2 nas raças Jersey (Gilliespie et al., 1999), Holandesa (Dietz et al., 1997), Criola Argentina (Giovambattista et al., 2001), Japanese Black e Japanese Shorthorn (Takeshima et al., 2003) e Gir, como as encontradas por Mota et al. (2002) e neste estudo, o que permite diferenciar e determinar as distâncias genéticas entre as diferentes populações, provendo base molecular para determinação de sua origem comum.

Os efeitos dos alelos DRB3.2 sobre a produção de leite em até 305 dias encontram-se na Tab. 2. Deve-se considerar que a seleção para produção de leite feita dentro de cada rebanho e, conseqüentemente, o descarte de vacas podem ter viesado as estimativas, pois foram considerados, nas análises, os registros do primeiro, segundo e terceiro partos. Ressalte-se que a comparação dos resultados obtidos em diferentes populações deve ser feita com reservas, pois o desequilíbrio de ligação existente dentro de cada uma delas pode ser diferente.

No rebanho B, cuja média±erro-padrão da produção de leite em até 305 dias foi igual a 3.024±73kg, encontrou-se associação significativa (P<0,05) entre alelos *16 e *29 e produção de leite. No rebanho A, no qual a média±erro-padrão da produção de leite foi igual a 4.698±94kg, não foram encontradas associações significativas entre essa característica e os alelos BoLA-DRB3.2, provavelmente devido ao tamanho da amostra.

De acordo com Starkenburg et al. (1997) e Sharif et al. (1998a), o alelo *16, na raça Holandesa, está relacionado a menores escores de células somáticas durante as lactações, refletindo em úberes mais saudáveis e, conseqüentemente, maiores produções. Ainda, esse mesmo alelo pode estar associado a menor incidência de cistos ovarianos e de retenções de placenta (Sharif et al., 1998a), segundo Xu et al. (1993), ele estaria associado ao aumento da persistência linfocitária, o que poderia explicar sua alta freqüência em ambos rebanhos, pois animais mais susceptíveis à mastite e com problemas reprodutivos seriam descartados com o passar dos anos. Tal suposição é reforçada pela baixa freqüência do alelo *23 (Tab. 1), que pode estar associado ao aumento de incidência de mastite clínica (Sharif et al., 1998b).

O padrão para o alelo DRB3.2*29, obtido por PCR-RFLP, que corresponde ao alelo DRB3.2*4101, foi identificado anteriormente por van Eijk et al. (1992), nas raças South Devon, Angus e Gelbivieh, e por Mota et al. (2002), na raça Gir, mas não foi encontrada na literatura nenhuma referência relacionando esse alelo a alguma característica produtiva. Neste estudo, o alelo *29 estava associado ao aumento significativo na produção de leite em até 305 dias no rebanho B, todavia, em razão de sua baixa freqüência, o resultado pode ter sido ocasional, como reflexo da amostragem.

Os resultados deste estudo mostraram a inexistência de associação entre os demais alelos BoLA e a produção de leite em até 305 dias na raça Gir. As prováveis causas podem ser o tamanho da população analisada, portanto, o reduzido poder estatístico, ou a real ausência de tais associações na população. Também, a inconsistência pode ter sido causada por diferenças no desequilíbrio de ligação ou por associações ocasionais.

Starkenburg et al. (1997) mostraram efeitos significativos dos alelos *3 e *7, respectivamente, na redução do escore de células somáticas e no aumento da produção de leite e de proteína nas duas primeiras lactações, na raça Holandesa, enquanto o alelo *8 estava associado a reduções nas produções de leite e de proteína. Sharif et al. (1998a) relataram associação significativa do alelo *3 e menores riscos de retenção de placenta.

Sharif et al. (1998b) mostraram que o alelo *11 não estava associado a alterações nas produções de leite, de gordura e de proteína, enquanto Dietz et al. (1997) descreveram associação genética entre alelos BoLA, dentre eles o alelo *27, e vários indicadores de imunidade inata e adaptativa em vacas holandesas.

Para os demais alelos (BoLA-DRB3.2*5, *6, *15, *18, *20, *31, *35, *42, *51 e *54) não foram encontradas na literatura quaisquer referências em estudos de associação com características de produção, de reprodução ou de resistência a doenças.

Procurou-se, também, verificar a existência de possíveis interações entre os alelos, por meio da análise conjunta dos genótipos dos animais, mas não foram encontrados resultados significativos.

Mota et al. (2002) argumentaram que uma fonte de incerteza relacionada ao loco BoLA-DRB3, é a falta de estudos do gado Zebu nas regiões tropicais. Apesar dos resultados pouco consistentes sobre a associação entre alelos BoLA e a produção de leite em até 305 dias devido ao limitado número de animais, este trabalho certamente contribuiu para maior conhecimento desse loco dentro da raça Gir, uma vez que foram identificados 13 alelos não encontrados por Mota et al. (2002), e sete novos alelos que não haviam sido relatados em raças zebuínas. Deve-se ressaltar que praticamente todos os estudos, que procuraram identificar possíveis associações entre alelos BoLA-DRB3.2, analisaram menor número de informações que este estudo. Como exemplo, podem ser citados os trabalhos de Lunden et al. (1993), Dietz et al. (1997), Kelm et al. (1997) e Gilliespie et al. (1999), os quais analisaram, respectivamente, 196, 127, 137 e 172 registros de produção e genótipos.

A potencial utilização dos alelos BoLA como marcadores de características de produção pode ser de menor importância, desde que a seleção tradicional seja bastante efetiva (Weigel et al., 1990). Além disso, se a seleção é praticada por muitas gerações, seria improvável que um gene de efeito maior benéfico não estivesse fixado na população, a menos que ele tivesse algum efeito deletério.

A seleção direta para resistência a doenças é pouco efetiva, tanto pela baixa herdabilidade dessas características quanto pela dificuldade e/ou complexidade de sua mensuração e avaliação. Deste modo, a aplicação da seleção assistida por marcadores e de técnicas de manipulação usando genes do complexo BoLA pode auxiliar na seleção para maior resistência a doenças, tendo como conseqüência indireta o aumento da produção de leite em razão das melhores condições gerais de saúde dos animais.

Há grande polimorfismo no loco BoLA-DRB3.2 na raça Gir, com identificação de sete alelos ainda não citados em raças zebuínas. Foram encontradas associações significativas dos alelos *16 e *29 com maiores produções de leite.

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