Objectivo do trabalho

Extração e quantificação, por espectrofotometria, do DNA genómico de células hepáticas de um ratinho descendente do cruzamento entre heterozigóticos relativamente ao gene Drg11 para posterior amplificação por PCR de fragmentos de DNA correspondentes ao gene supracitado e ao gene reporte LacZ e análise por eletroforese de modo a determinar o seu genótipo.

Métodos
• Extração e quantificação do DNA genómico
1- Escolheu-se 1 tubo (caixa a -20ºC) com uma porção de fígado de ratinho, macerou-se o tecido, o melhor possível, com um pistão de teflon e vortexou-se a solução durante 5 minutos.
2- Adicionou-se 400 l de tampão de extração (200mM Tris-HCl pH 7.5; 250mM NaCl; 25mM EDTA; 0.5% SDS; Proteinase K) e …exibir mais conteúdo…

9- Aplicou-se a corrente elétrica (100 V) e deixou-se correr tempo suficiente para separar as amostras (cerca de 20 min).
5 – Desligou-se a fonte de alimentação elétrica e analisou-se o gel no transiluminador de UV.

Resultados

G2 F.Diluição A260 A280 1:10 0,410 0,232 1:100 0,038 0,032

Cálculos:
-Diluição do DNA 1:10 (no final da sua extração)
20µl de DNA e 180µl de H2O
-Diluição do DNA 1:100 (no final da sua extração)
2µL de DNA e 198µl de H2O
-Grau de pureza
A260

A280

-Quantificação do DNA da amostra
1 Unidade A260―50µg/ml de DNA 0.410 UA260 ―X
X=20.5µg/ml DNA

-Quantificação do DNA total
20,5 x 10(factor de diluição) = 205 µg/ml o que corresponde a 205ng/ml

-Diluição do DNA, 1:10 (para posterior adição de 1µl as soluções de Drg11 e LacZ )
1µl de DNA(inicial) + 9 µL de H2O = 20,5 ng/ml de DNA

No final da segunda etapa desta atividade laboratorial, após eletroforese em gel de agarose, o grupo em questão obteve um gel com a disposição de bandas visível na Imagem 1 e representada no Esquema 1. Tal com é possível verificar na Imagem 1, formou-se uma coluna com diversas bandas à frente do poço 1, que corresponde ao padrão de peso molecular; à frente do poço 2, que continha o DNA genómico, apenas é visível uma ténue mancha vertical que se estende ao longo da zona de corrida deste conjunto de poços; à frente do poço 3, que continha o controlo positivo