Química de los Flavonoides (página 2)

Partes: 1, 2

Aislamiento
Si estamos buscando agliconas en el material vegetal, podemos realizar un lavado con solventes no polares como el caso de cloruro de Metileno, éter di etílico, acetato de etilo. (aunque se encuentra raramente bajo la forma de agliconas)
Normalmente la extracción podemos realizarla bajo un equipo soxhlet a 60 C durante 2 horas y comprobar la presencia de Agliconas en dicho extracto.
Luego podemos proceder a realizar una extracción con mezclas de MeOH: H2O, la eficiencia de la extracción puede mejorar con sonificacion del material vegetal

Aislamiento
Los flavonoides en el material vegetal se encuentran siempre conjugados con o-glic o c-glic, raramente se encuentra bajo la forma de aglicona.
Para casos practico de aislamiento sera necesario separar estos glucósidos del esqueleto de los flavonoides, para esto se propone una hidrolizar acida.

Aislamiento
Sistemas Cromatográficos para la extracción: existen varios sistemas para la extracción de las Isoflavonas mediante columnas Cromatográficas.
Fases estacionarias: Poliamida, Sephadex LH20, C18 RP
Fases Móviles: Migración y mixturas de compuestos Polares a Hidrófobicos

Solventes de
desarrollo
Serie
eluotropa
El poder eluyente
aumenta con la
Polaridad del
disolvente
-Hexano
-Tetracloruro de carbono
-Benceno
-Diclorometano
-Cloroformo
-Eter dietilico
-Acetato de etilo
-Acetona
-Isopropanol
-Etanol
-Metanol
–Agua
Aumenta
el poder
eluyente
Polaridad
creciente

Caracterización
Son moléculas difíciles de caracterizar, normalmente se determinan bajo el brillo en presencia de fluorescencia, de color azul intenso, que cambia a Marrón intenso en presencia de vapores de amoniaco.

Características espectrales de las Isoflavonas

Espectroscopia UV
La banda II de absorción de las Isoflavonas normalmente ocurre en la región de 245-270 nm y generalmente no es afectada por el incremento de la Hidroxilacion del anillo B, pero si es desplazada bato crómicamente por Hidroxilacion del anillo A

Características de las espectroscópicas:
Isoflavonas Polioxigenadas, que tengan la banda II de absorción, entre 265 y 270 generalmente son trioxigenadas en el anillo A.
La metilación o Glicosilacion de 7 o 4’-OH tiene un pequeño o muy pequeño efecto sobre el espectro UV, Mientras que una sustitución en el 5-OH causa un ligero desplazamiento Hipsocromico.

Espectroscopia uv
Reactivos de Desplazamiento

Técnicas Espectrométricas
Los tipos de análisis mas importantes para el trabajo con flavonoides, son los relacionados con la Espectrometría de MS, MS/MS y la RMN 1H y RMN 13C.
El trabajo con IR no ayuda en gran manera, debido a la cantidad de señales iguales, que se solaparían.

Es una técnica instrumental sofisticada que separa y detecta iones en fase gaseosa. Se basa en ionizar moléculas gaseosas convirtiéndolas en iones (generalmente cationes), que se separan al ser acelerados por un analizador de masa: la separación se basa en la distinta relación m/z de los iones.
Espectrometría de masas

ESPECTRÓMETRO DE MASAS
Componentes del instrumento
Introducción de la muestra
Fuente de ionización
Separador de masas
Detector iónico
Procesador de señal
Registrador
El acoplamiento entre CG y HPLC con EM se analizará más adelante

Ionización por impacto electrónico
Ionización química
Fuente de bombardeo con átomos rápidos
Desorción con láser
Ionización a presión atmosférica:
– Electronebulización asistida con un gas: electrospray
– Ionización química a presión atmosférica
– Fotoionización a presión atmosférica
Fuentes de ionización
HPLC

Ionización por impacto electrónico
placa de repulsión
placas focalizadoras
haz de electrones (70 eV)
moléculas neutras
moléculas neutras
placas aceleradoras (4000 V)

(Gp:) filamento de W

(Gp:) iones

(Gp:) M + e M.+ + 2e

ion molecular

Fragmentación del ion molecular
Molécula hipotética ABCD (A, B, C y D = átomos)
Fragmentación del ion molecular
ABCD.+ + ABCD (ABCD)2.+ BCD. + ABCDA+
Colisión seguida de fragmentación
(Gp:) ABCD.+ ADBC.+
(Gp:) BC. + AD+
AD. + BC+

Reordenamiento seguido de fragmentación
(Gp:) ABCD + e ABCD.+ + 2 e
ABCD.+ A+ + BCD.
A. + BCD+ BC+ + D
CD. + AB+
AB. + CD+
(Gp:) B + A+
A + B+
(Gp:) D + C+
C + D+

Ionización química
(Gp:) CH4+ + CH4 CH5+ + CH3
CH3+ + CH4 C2H5+ + H2

(Gp:) CH5+ + MH MH2+ + CH4
C2H5+ + MH M+ + C2H6

(Gp:) CH4 + e (alta energía) CH4+ y CH3+

(Gp:) Gas reactivo metano, isobutano, amoníaco (cámara de ionización de “alta” presión a 10 torr)

Transferencia protónica entre molécula reactiva y analito

Espectrómetro de masas de sector magnético
Espectrómetro de masas de cuadrupolo
Espectrómetro de masas de tiempo de vuelo
Espectrómetro de masas de trampa iónica
Separador de masas

Espectrómetro de masas de sector magnético

¿cómo se separan los iones de distinta masa?
m : masa
v : velocidad de la partícula
m : masa
z : carga
V : diferencia de potencial
(Gp:) FM = Bzv
FC = mv2/r
(Gp:) mv2/r = Bzv
v = Bzr/m

FM : fuerza centrípeta
FC : fuerza centrífuga
B : campo magnético
r : radio de curvatura
Bzr/m = (2zV/m)½
m/z = B2r2/2V
(Gp:) Ecinética = ½ mv2 = zV
v = (2zV/m)½

Espectrómetro de masas de cuadrupolo
(Gp:) Ø = 6 mm

Espectrómetro de masas de cuadrupolo

(Gp:) Potencial corriente directa
(Gp:) tiempo
(Gp:) masa
(Gp:) Potencial de radiofrecuencia

Relación de voltajes durante un barrido de masa con un analizador cuadrupolo

EM de tiempo de vuelo (TOF: time of flight)
pulsos de 300 V, 3.000-20.000 veces/s

Espectrómetro de masas de trampa iónica
electrodo anular central
tapa
tapa
Vrf

Esquema detector de trampa iónica (ITP)

Espectros de masas
Energía de ionización de la molécula
Grupos funcionales de la molécula
Método de ionización
Presión y temperatura de trabajo
Diseño instrumental
Dependen de:

Espectros de masas obtenidos por impacto electrónico
En este ejemplo el pico base se forma por pérdida de CH3
(Gp:) Etilbenceno

(Gp:) pico base

ion molecular (ion “parent”)
M+ ? fragmento de mayor masa
molécula con número par de N ? M+ con masa par
molécula con número impar de N? M+ con masa impar
4 H ? M-4 F ? M-19
CH3? M-15 HF ? M-20
NH3 ? M-17 C2H2 ? M-26
H2O ? M-18
Átomos y grupos frecuentemente desplazados