Soluciones Electroforesis

Protocolo y Técnicas

Cultek

Electroforesis de Proteínas

Las proteínas son moléculas cuya carga neta depende del contenido de una serie de aminoácidos (fundamentalmente ácido glutámico, ácido aspártico, lisina, arginina e histidina) y del grado de ionización de éstos al pH considerado (figura 7).

Fig. 7. Principales aminoácidos responsables de la carga neta de una proteína, dependiendo del pH. En los soportes no restrictivos (en los que el entramado no interfiere en la migración, ya que el tamaño de las proteínas es muy pequeño en comparación con el tamaño de poro del soporte), la separación depende de la densidad de carga de las moléculas y, así, cuanto mayor sea la densidad, mayor será la velocidad …ver más…

En la primera parte, se realiza una aplicación puntual de la muestra, por lo que al final las distintas proteínas estarán distribuidas a lo largo del gel según el eje de migración. Acabada la electroforesis, y sin efectuar la tinción, se practica en el gel un canal (“trinchera”) paralelo a la dirección de migración con un bisturí de doble hoja (la separación de las hojas determina la anchura de la trinchera) en el que se deposita un antisuero que contenga anticuerpos específicos frente a una o varias de las proteínas separadas en la electroforesis. Los geles se mantienen así a temperatura ambiente (20-22°C) durante 24-48 horas. Los anticuerpos y las proteínas (que actúan como antígenos) difunden, y si se encuentran en la proporción adecuada, producen complejos antígeno-anticuerpo insolubles que precipitan y aparecen en el gel como bandas elipsoidales. Estos complejos solamente se producen cuando ambos compuestos se hallan en lo que se conoce como relación de equivalencia y que no son idénticas para todas las proteínas presentes en la muestra; por eso, deben determinarse en experimentos preliminares las cantidades idóneas de antisuero y de la muestra, así como las distancias entre el pocillo de aplicación de la muestra y la trinchera, ya que si las distancias son muy pequeñas, el antígeno (las proteínas) difunde rápidamente y puede no formarse el precipitado, y si la distancia es mayor de la idónea, hay que emplear mayor