CUANTIFICACIÓN DE AMINOACIDOS
(MÉTODO DE NINHIDRINA)

INTRODUCCIÓN

Hace muchos años, Ruhemann demostró que los aminoácidos y la ninhidrina reaccionan con gran sensibilidad para dar un compuesto púrpura, ahora conocido como púrpura de Ruhemann. El ensayo se basa en la reacción con ninhidrina del grupo amino de aminoácidos libres y de los grupos amino de la molécula proteínica. Este proceso transcurre en varias etapas. En un principio, como resultado de la interacción del aminoácido con la ninhidrina se forma una base de Schiff. Luego ésta sufre un reagrupamiento, se descarboxíla y se descompone en aldehído y aminodicetohidrindeno como se observa en la siguiente figura:

El aminodicetohidrindeno se condensa con otra …ver más…

Reactivo de Ninhidrina 2% en metilcelosolve.

MÉTODO

1. Prepare los tubos con las soluciones indicadas según la siguiente tabla. Utilice como muestra problema el extracto acuoso separado en la práctica 1 sección A:

TUBO
REACTIVO ( ml ) Blanco 1 2 3 4 5 6 7 8
Patrón de Leucina 100 g/ml - 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 - -
Agua destilada 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.9 0.9
Muestra problema - - - - - - - 0.1 0.01
Reactivo de Ninhidrina 2% 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

2. Mezcle suavemente los tubos y tápelos con papel aluminio.

3. Incúbelos en baño María a ebullición durante 15 minutos. Transcurrido el tiempo enfríelos sumergiendo los tubos en un poco de agua fría cuidando que no se contaminen con el agua.

4. Agregue a cada tubo 5 ml de etanol al 50 % a cada tubo y agite.

5. Obtenga en el espectrofotómetro la A570 de las mezclas de la curva patrón y de los problemas (Tubo 7 y 8), calibrando con el contenido del tubo 1 (blanco de reactivos).

6. Con los resultados construya una curva patrón graficando g de proteína vs absorbancia, en ella interpole el valor de absorbancia del tubo problema para determinar:
• la concentración de aminoácidos en 0.1 y 0.01 ml de la muestra y
• la concentración total de aminoácidos de la muestra problema en mg por gramo de tejido.

CUESTIONARIO

1.- ¿Puede considerarse que un solo