Técnicas de estudio del cariotipo (página 2)

Cuando se desarrolló la técnica, se pensó
que el SKY podría detectar alteraciones en los pacientes
con neoplasias hematológicas pero que presentaban
cariotipo normal. Algunos trabajos recientes muestran que el SKY
detecta alteraciones crípticas en un porcentaje muy bajo
de estas muestras. Estos resultados, junto con el hecho de que es
una técnica laboriosa y cara, sugieren que probablemente
el SKY no es la técnica de elección para el estudio
de casos con un resultado citogenético normal.

Las distintas técnicas
genéticas no se excluyen, son complementarias unas de
otras. Lo importante es valorar qué tipo de estudio se
debe utilizar en cada caso. Esto se aplica también al SKY,
que siempre se debe utilizar como un método
complementario del análisis de bandas G. El cariotipo
convencional permite analizar un mayor número de metafases
y proporciona una descripción más exacta de las bandas
implicadas en los reordenamientos.

En conclusión, el SKY puede representar un importante
instrumento en el análisis citogenético,
especialmente en casos con cariotipos complejos. La capacidad de
discernir diferencias genéticas entre poblaciones de
células
leucémicas similares morfológica e
inmunológicamente está ayudando a establecer las
bases para una revisión de la clasificación de
neoplasias hematológicas. La utilización conjunta
de estas técnicas está aportando datos a una
investigación dirigida a identificar
factores pronósticos en estos pacientes.

 Los Estudios Cromosómicos De Bandeo
Extendido

Los estudios de bandeo extendido o de
"alta resolución" implican el estudio de los cromosomas
con una resolución más alta que la del
análisis cromosómico estándar mencionado
anteriormente. Los cromosomas están dispuestos de manera
tal que se alargan un poco, por lo que se pueden ver más
bandas. Esto permite observar partes más reducidas del
cromosoma e identificar, de este modo, anomalías
cromosómicas estructurales más pequeñas
que no pueden ser vistas en un análisis de
rutina.

La Hibridación
Fluorescente In Situ (Su sigla en inglés es FISH)

La hibridación fluorescente in
situ es una técnica de laboratorio
que determina cuántas copias de un segmento
específico de ADN existen en
una célula. También se utiliza para
identificar cromosomas con estructuras
anómalas. En el laboratorio, se modifica
químicamente un segmento de ADN y se lo marca de manera
que pueda ser visto fluorescente (muy brillante) utilizando un
microscopio
especial. Este ADN se conoce como "sonda". Cuando se las coloca
en las células bajo ciertas condiciones, las sondas
pueden detectar segmentos homólogos de ADN.

Por ejemplo, si se sospecha que un
bebé padece del síndrome de
Down de trisomía 21 y se realiza una amniocentesis
durante la gestación, las células detectadas en
el líquido amniótico pueden estudiarse a
través de una hibridación fluorescente in situ.
Una sonda hecha para el cromosoma 21 puede determinar la
cantidad de copias del cromosoma 21 que el bebé posee.
Con un microscopio especial, se vería que las
células del bebé con trisomía 21 contienen
tres "marcas" o tres
áreas brillantes, en donde la sonda detectó los
tres cromosomas 21. El estudio de hibridación
fluorescente in situ no reemplaza un estudio cromosómico
estándar, sino que lo complementa según el
defecto congénito del que se trate.

La hibridación fluorescente in
situ se puede utilizar para detectar anomalías
cromosómicas estructurales (como las delecciones
submicroscópicas) que se encuentran más
allá de la resolución de los estudios
cromosómicos de bandeo extendido.

"Telómero" es un término
que se utiliza para describir los extremos de los cromosomas.
Cuando se utiliza la hibridación fluorescente in situ
(su sigla en inglés es FISH) específicamente para
buscar anomalías cromosómicas en esta zona, se la
denomina " examen subtelomérico FISH" .

Las sondas usadas en la FISH se pueden clasificar en:

Sondas que identifican
una estructura
específica y repetitiva del cromosoma

Estas sondas hibridan con las secuencias α y
ß satélite adyacentes al centrómero,
que son específicas de cada centrómero, pero que
varían de un cromosoma a otro. Las sondas
centroméricas permiten identificar alteraciones de tipo
numérico, especialmente monosomías y
trisomías y otras aneuploidías tanto en las
cromosomopatías (Síndrome de Turner,
síndrome de Down, síndrome de Klinefelter) como
en los tumores (trisomía 8 o monosomía 7 en
leucemias agudas).

Hibridación in situ fluorescente de doble color en un
enfermo con leucemia aguda mieloblástica y
pérdida en 7q. El centrómero del 7 se observa en
color verde y en color rojo está marcada una secuencia
específica de 7q. Se advierte la presencia de una
pérdida de 7q tanto en metafase como en interfase.

Sondas que hibridan simultáneamente con
múltiples secuencias del cromosoma

Se denominan sondas de pintado cromosómico a aquellos
fragmentos de ADN que se obtienen mediante separación
cromosómica por citometría de flujo y se marcan
directamente mediante DOP-PCR. Sólo pueden utilizarse en
metafase y sirven para detectar alteraciones estructurales
(translocaciones, cromosomas marcadores, derivativos, etc.)
difíciles de identificar con la citogenética
convencional, como la t(12;21)(p12;q22) en la leucemia aguda
linfoblástica B del niño.

Sondas que hibridan con una única secuencia de
ADN

Estas sondas permiten sobre todo detectar reordenamientos
estructurales de genes o de regiones cromosómicas
concretas. Para poder
utilizarlas es necesario conocer a priori la región
candidata a estudio en cada patología. Sus aplicaciones
son: a) la detección de translocaciones
cromosómicas tales como la t(9;22)(q34;q11), con
fusión de los genes BCR y ABL, en la
leucemia mieloide crónica o la t(11;14)(q13;q32), donde
BCL-1 se transloca a la región de la cadena pesada de
las inmunoglobulinas, en el linfoma del manto (fig. 3); b) el
estudio de pérdidas de genes concretos, como el gen del
síndrome de Prader-Willi, o la pérdida de P53 en
tumores, y c) el estudio de genes que se amplifican, es decir,
se multiplican de manera considerable en el núcleo de
la
célula tumoral, como N-MYC en el neuroblastoma.

Fig. 3. Hibridación in situ fluorescente en interfase
y metafase de un enfermo con linfoma del manto y t(11;14). La
sonda específica del gen en la cadena pesada de las
inmunoglobulinas se ha marcado en verde y la del gen de la
ciclina D1 (BCL-1) en rojo. Se observa la presencia de
fusión de ambos genes en los dos cromosomas derivativos
y en el núcleo en interfase (flechas)

Análisis de
Microarreglo Cromosómico

Un  análisis 
de  microarreglo  cromosómico 
(CMA,  por  sus  siglas  en 
inglés)  es  un  nuevo 
análisis  que  se  utiliza 
para  detectar  desequilibrios 
cromosómicos  a  una 
resolución  mayor  que  las
técnicas  cromosómicas 
estándar  actuales o  las 
técnicas FISH.

Una  muestra 
del  ADN  del  individuo  a  examinar  y 
una  muestra  de  ADN  para  control  se  disponen  en 
un  orden  (arreglo)  particular 
sobre  un  portaobjetos  de  vidrio. A 
las  muestras  de  ADN  se 
añade  colorante  fluorescente. Luego se
colocan los portaobjetos en un lector especial que mide el
brillo de cada área fluorescente.

Este  proceso  busca  identificar 
un  cambio 
en  el  número  de  copias 
de  ADN. Estos  cambios  en  los 
números  de  copias  de  ADN 
pueden  representar  cambios  observados 
en  la  población  general,  los 
cuales  no  causan  enfermedades 
genéticas. Sin  embargo,  algunos 
cambios  en  los  números  de 
copias  pueden  indicar  una 
anomalía  cromosómica,  como 
un  desequilibrio  cromosómico, 
pérdida  o  ganancia. Los  tipos 
de  anomalías  cromosómicas 
pueden  incluir  pequeñas 
reordenaciones  cromosómicas, 
pequeñas  duplicaciones  de 
material  cromosómico  (trisomia), 
o  pequeñas  supresiones  de 
material  cromosómico  (monosomia). Entre los
tipos de microarreglos tenemos:

           
Microarreglos que detectan ganancias y pérdidas de
genes (pérdida de  heterogenicidad)

           
Ciertas pérdidas o ganancias cromosómicas
están relacionadas con la progresión del
cáncer y los patrones de estos cambios son importantes
para establecer un pronóstico clínico. Con el uso
de microarreglos y el análisis de sus resultados se
podría predecir cuáles regiones
cromosómicas contienen genes que inician y mantienen
procesos
tumorales. Los resultados pueden ser visualizados en diagramas
jerárquicos referidos como " modelos en
árbol de progresión del tumor" .

           
La técnica de Microarreglos de Hibridización
Genómica Comparativa permite visualizar ganancias y
pérdidas o cambios en el número de copias de un
gen particular involucrado en determinada patología. En
este tipo de microarreglos se usan grandes porciones de ADN
genómico que sirven como ADN inmovililizado en el plato
y cada punto o spot de ese ADN representa una región
cromosómica conocida. La mezcla a hibridizar
contendrá ADN genómico marcado, proveniente de
tejido enfermo y tejido sano. Si el número de copias del
gen de interés
están aumentadas, una gran cantidad de ADN de la muestra
se hibridizará en los puntos o spots del microarreglo
que representan el gen involucrado, mientras que al utilizar
muestra proveniente de tejido sano sólo un
pequeño número se hibridizará en el mismo
punto. Dicha diferencia en la cantidad de material hibridizado
podrá reflejarse en fluorescencias disímiles y
así será detectado por el escáner
y por los programas de
lectura.

 Microarreglos
que detectan mutaciones en el ADN

Cuando se utilizan los microarreglos para detectar
mutaciones o polimorfismos en una secuencia génica, el
ADN inmovilizado suele ser un único gen; el material
colocado en otros pozos puede diferir solamente en uno o en
unos cuantos nucleótidos. Un tipo de secuencia que suele
utilizarse para este tipo de análisis son los Single
Nucleotide Polymorphism (SNP) o Polimorfismo de
nucleótido único, pequeña variación
genética que puede ocurrir dentro del ADN
de un individuo. En este tipo de experimento se necesita ADN
genómico derivado de una muestra normal para ser usado
en la mezcla de hibridización. Una vez que los
investigadores han establecido que un SNP se relaciona con una
enfermedad de interés, pueden usar la tecnología para detectar quiénes
tienen o son susceptibles de tener la enfermedad. Cuando el ADN
genómico de un individuo se hibridiza con un arreglo
cargado de varios SNPs, el ADN muestra (target) se
hibridizará con mayor frecuencia con los SNPs asociados
al individuo a estudio. Estos puntos del microarreglo
tendrán mayor fluorescencia y se demostrará que
dicha persona es
susceptible o tiene determinada enfermedad

Hibridación genómica
comparada

En la HGC se produce la hibridación de ADN tumoral y
ADN normal frente a cromosomas normales. Esta técnica
presenta la ventaja de no necesitar material en fresco, ya que
el ADN se puede obtener de tejido en parafina. Con ella se
pueden conocer alteraciones numéricas (pérdidas o
ganancias de material genómico), pero no la presencia de
translocaciones recíprocas. Su aplicación al
estudio de los tumores ha puesto de manifiesto que en la
mayoría de las neoplasias hay alteraciones
genéticas.

Fundamento de la hibridación genómica
comparada

La HGC consiste en la hibridación competitiva entre
ADN tumoral (test) y ADN
normal (referencia) sobre metafases normales en presencia de un
exceso de ADN Cot-1 humano. Previamente, el ADN tumoral y el
ADN normal han sido marcados con dos fluorocromos diferentes
(por ejemplo, el ADN tumoral con un fluorocromo verde y el ADN
normal con uno rojo) lo que permitirá su posterior
identificación mediante un microscopio de fluorescencia.
El análisis digital de las metafases capturadas
cuantifica

la proporción de verde y de rojo en todos los
cromosomas de manera que si existe una ganancia de material
genético en una determinada región
cromosómica se producirá un aumento de la
fluorescencia verde a ese nivel, mientras que si hay una
pérdida de material genético se producirá
una disminución de la fluorescencia verde y por tanto un
aumento relativo de la fluorescencia roja. El cariotipaje
posterior se realiza sobre la base de la tinción con
DAPI de los cromosomas.

La HGC ha sido la primera técnica combinada de
citogenética e hibridación in situ fluorescente
que ha permitido realizar un análisis global del genoma.
Puesto que las alteraciones en el número de copias de
ADN de determinadas regiones tienen una gran importancia en la
patogenia del cáncer, la HGC ha despertado gran
interés en el estudio de las neoplasias. La HGC ha sido
utilizada de forma más amplia en el estudio de los
tumores sólidos que de las neoplasias
hematológicas, entre otras razones por la dificultad que
entraña obtener mitosis en
los tumores sólidos, y porque los reordenamientos no
recíprocos y las amplificaciones génicas se
producen con más frecuencia en ellos que en las
neoplasias hematológicas. No obstante, puesto que la HGC
no requiere metafases de las células tumorales y no
está afectada por la selección clonal inherente a los cultivos
celulares, se ha utilizado en hemopatías malignas. Las
neoplasias linfoides B representan el grupo
más estudiado y más concretamente los linfomas no
Hodgkin (LNH) en los que se ha demostrado que las
amplificaciones constituyen una alteración más
frecuente de lo que se suponía, y que se asocian
generalmente a linfomas agresivos. Otra aportación
importante de la HGC al conocimiento

de la patogenia de los linfomas ha sido la
demostración de que la amplificación es otro
mecanismo que causa sobreexpresión de la proteína
bcl-2, añadido al ya conocido mecanismo de
translocación.

Referencias
Bibliográficas

1. REVISTA
COLOMBIANA DE REUMATOLOGÍA VOL. 12 No. 3,
Septiembre    2005, pp. 263-267

2. Yunis JJ. High resolution of human chromosomes. Science
1976;191:1468-71
3. Rowley JD. The role of chromosome translocations in
leukemogenesis..
4. Pinkel D, Straume T, Gray JW: Cytogenetic analysis using
quantitative, high-    sensitivity, fluorescence
hybridization. Proc Natl Acad Sci USA 1986;83:2934-8.

5. Bentz M, Dohner H, Cabot G, Lichter P. Fluorescence in
situ hybridization in leukemias: 'the FISH are spawning!'.
Leukemia 1993;8:1447-52.

Autor:

Marcos Jonathan Alcántara Trujillo