Mediante el uso de técnicas
inmunológicas se ha detectado material glucoproteico
procedente también de la fusión
de vesículas del aparato de Golgi (Perotto S. y col.,
1991). A finales de la década pasada, se identificó
a uno de los componentes glucoproteicos del fluido como miembro
de la familia de
las lectinas y se le ha llamado PsNLEC-1 (Dahiya P. y col.,
1997). Se ha demostrado que la presencia de estas lectinas
está relacionada con la maduración de la bacteria
hacia bacteroide, ya que en mutantes de guisante incapaces de
glucosilar a estas proteínas
los bacteroides detienen su desarrollo en
una forma inmadura (Dahiya P. y col., 1998).
La diferenciación de los bacteroides fue observada por
primera vez por Beijerinck en 1888 (Beijerinck M.W., 1888).
Dependiendo del sistema
simbiótico, los rizobios al invadir las células
del córtex sufren un destino distinto. En nódulos
indeterminados las bacterias que
se liberan al citoplasma dejan de dividirse poco después
de diferenciarse. En el proceso de
diferenciación pueden o bien aumentar su tamaño
original de cuatro a siete veces, como es el caso de
Sinorhizobium meliloti, o bien adquirir un forma de "Y",
como el caso de Rhizobium leguminosarum. En nódulos
determinados sin embargo, las células infectadas mantienen
momentáneamente la actividad mitótica por lo que
las bacterias en el interior de la gota endofítica siguen
dividiéndose con el fin de poder mantener
su presencia en las células vegetales recién
formadas. Al igual que en nódulos indeterminados las
bacterias incrementan su tamaño aunque no cambian de
forma.
Esquema de funcionamiento de un
nódulo
ACTIVIDAD DE LA
NITROGENASA: SUBUNIDADES, SÍNTESIS, MECANISMOS DE
ACCION
NITROGENASAS
Todos los microorganismos que convierten el N2 en
amoniaco lo hacen gracias a la actividad del complejo
enzimático Nasa; la enzima requiere de la
colaboración de otras dos proteínas llamadas
ferrodoxina y flavodoxina; éstas actúan como
donadores de electrones y reductores naturales de la
Nasa.
El complejo enzimático Nasa, que cataliza la
reducción del N2 en amoniaco, está constituido por
dos metaloproteínas, y contiene tres tipos de grupos
prostéticos. La
nomenclatura para designar estas proteínas es
variable. Así, la proteína I es llamada
también dinitrogenasa o "Fierromolibdeno-
proteína". El otro componente, la proteína II, es
igualmente nombrada dinitrogenasa reductasa o
"Fierro-proteína".
Para su funcionamiento, el complejo requiere un donador
de electrones de bajo potencial, de la hidrólisis de ATP y
de un ambiente
estrictamente anaerobio. La proteína I es un
tetrámero de alrededor de 220,000 Da, formado por dos
tipos de subunidades α2 β2,
de masa molecular semejante, y que son los productos de
los genes nifDK . Esta proteína contiene el
cofactor con fierro y molibdeno (FeMo-Co). La composición
metálica global de la proteína I es de 2Mo, 30 Fe y
30S. Por lo tanto, la proteína contiene además dos
grupos prostéticos diferentes: cuatro grupos 4Fe-4S,
llamados grupos P ligados de manera covalente a residuos de
cisteína de las subunidades α y β
y los dos grupos FeMoCo unidos a la subunidad α, donde se
propone que son transportados los electrones y es reducido el
N2. La proteína II es un dímero de
alrededor de 68,000 Da, formado por dos subunidades
idénticas unidas por un grupo
prostético único de 4Fe-4S. El gene responsable de
la síntesis
de esta proteína es nifH. Esta proteína
tiene la función de
transportar los electrones del donador fisiológico de
electrones (ferrodoxina o flavodoxina),
hacia la proteína I para llevar a cabo la
reducción de la molécula de N2, (Figura 3). La Nasa
es sumamente lábil a la inactivación por el 02; de
hecho, para su purificación se requieren condiciones
anaeróbicas estrictas debido a que el cofactor FeMoCo es
irreversiblemente desnaturalizado y oxidado (Figura 4). La FBN es
un proceso que requiere un gasto considerable de energía,
de ahí que su biosíntesis esté sometida a una
estricta regulación. Ha sido determinado que, bajo
condiciones de laboratorio,
se requieren 16 moléculas de Mg-ATP y se produce
además una molécula de H2.
La ecuación global es:
N2 + 8H+ + 8e- + 16 Mg-ATP 2NH3 + H2 +
16Mg-ADP + 16Pi
En condiciones naturales se ha estimado que la demanda
energética es mucho mayor de 20-30 moléculas de
ATP. Por esta razón, los microorganismos han seleccionado
mecanismos para inactivar a la enzima cuando está
disponible el nitrógeno combinado; esto le permite
mantener las necesidades del microorganismo
y evitar un gasto energético inútil.
La hidrólisis de ATP está acoplada a la
transferencia de electrones (e-) hacia la proteína I; dos
moléculas de ATP son hidrolizadas por cada par de e-
transferidos. Se piensa que los grupos P tiene una función
en la transferencia de e-. De manera similar, el complejo de la
Nasa cataliza igualmente la reducción de análogos
estéricos del N, en particular el acetileno, que es
reducido a etileno. Esta propiedad es
la base de un método
relativamente sencillo para analizar la actividad de la Nasa por
cromatografía en fase gaseosa. Este
método ha permitido también el descubrimiento de
otros diazótrofos utilizando el sencillo medio de cultivo
sin nitrógeno llamado
nfb (nitrogen fixation biological), descrito en Brasil por Joanna
Döbereiner.1 En este medio se adiciona una fuente de
carbono y
algunas sales, la fuente de N es el molecular, por lo tanto los
únicos microorganismos que se desarrollarán
serán aquellos que sean capaces de FN. Se inocula al medio
una porción de raíz, del nódulo o bien la
bacteria ya aislada por picadura y el desarrollo del
microorganismo se realizará en la zona en la cual exista
una p02 menor a 0.02% (microaerofilia) debido a que, como ya se
mencionó, la enzima es sumamente sensible a este gas. Este
método ha permitido aislar e identificar
diazótrofos de diferentes habitats.
En 1972, Dixon y Postgate (citado en 3), transfirieron
los genes nif (por nitrogen fixation) de Klebsiella
pneumonie a Escherichia coli creando una nueva especie
fijadora de nitrógeno.
Ello condujo a proponer, como una solución al
problema de la nutrición vegetal, la
transferencia directa de los genes nifHDK a las plantas.
Este objetivo
está lejos de ser obtenido, ya que la genética
de la FBN ha resultado sumamente compleja y está sometida
a un control estricto
y refinado, justamente por la importante demanda
energética. Se han descrito alrededor de 20 genes
involucrados en la FBN, cuya secuencia y funciones han
sido ya determinadas. Se ha descrito también que los genes
estructurales de la Nasa están sumamente conservados,
así como un cierto número de otros genes cuyos
productos juegan un papel en la maduración de la enzima,
la síntesis del cofactor, el transporte de
Molibdeno (Mo) y la regulación.
3 En el microorganismo diazótrofo de vida libre
Azotobacter vinelandii, se describieron por vez primera
tres Nasas diferentes. Una de ellas es la "convencional" Nasa a
Mo. Esta Nasa-1 es expresada en medio que conteniene Mo. Las
otras dos, llamadas Nasas "alternativas", incluyen a la Nasa-2;
ésta es un complejo enzimático que contiene Vanadio
(V) en lugar de Mo. Tal complejo enzimático está
formado por dos componentes:
la dinitrogenasa reductasa-2, un dímero de dos
subunidades idénticas, y la dinitrogenasa-2, la cual es un
hexámero de MMr 240,000 Da con tres tipos diferentes de
subunidades (α, β y δ). La
dinitrogenasa reductasa-2 tiene una masa molecular relativa de
alrededor 62,000 Da, contiene cuatro αtomos de
Fe y cuatro grupos -SH ácido lábil por
dímero; la dinitrogenasa-2 contiene dos átomos de
V, 23 átomos de Fe y 20 grupos -SH ácido
lábil por molécula. El cofactor FeVaCo
análogo al FeMoCo se ha extraído de la
dinitrogenasa. La Nasa-3 contiene Fe en lugar de Mo y V.
Constituida también por dos componentes, la dinitrogenasa
reductasa es un dímero de 65,000 Da y dos subunidades
idénticas; la dinitrogenasa es un tetrámero de dos
subunidades (α y β); esta
ϊltima Nasa tiene un gasto energético de
ATP
mucho mayor.2 Un reciente y excitante hallazgo realizado
por investigadores alemanes (Meyers y cols.,9), se refiere a una
Nasa aislada de Streptomyces thermoautotrophicus, la cual
presenta varias características originales: los
requerimientos energéticos (ATP) son considerablemente
menores, la reacción está acoplada a la
oxidación del monóxido de carbono (CO) por una
enzima adicional, la molibdeno CO deshidrogenasa, que transfiere
los electrones derivados de la oxidación de CO al O2,
produciendo radicales del anión superóxido (O2
-).
Una superóxido reductasa reoxida los aniones O2 –
a O2 y transfiere los electrones a la Fe-Mo S dinitrogenasa para
la reducción de N2 a amonio; la enzima no es capaz de
reducir etino y eteno; además, es relevante destacar que
los componentes de la Nasa son expresados constitutivamente; todo
lo anterior hace a esta nueva Nasa sumamente atractiva para su
estudio molecular. En resumen, una de las más
sorprendentes propiedades del complejo enzimático de la
Nasa de S. thermoautotrophicus es su dependencia del O2 –
y la insensibilidad
de todos los componentes al O2 y H2O2. Los componentes
de esta Nasa son estructuralmente diferentes de las otras Nasas,
por lo tanto, los genes que codifican para este complejo
enzimático no están relacionados con los genes de
las "Nasas convencional y alternativas".9 Estequiometría de la Nasa de S.
thermoautotrophicus.
N2 + 8H+ + 8e- + 4-12 Mg-ATP 2NH3 + H2
+ 4-12Mg-ADP + 4-12Pi
La sequía reduce la fijación de
nitrógeno en leguminosas
En condiciones de sequía, se produce una
limitación de carbono en los nódulos de las
leguminosas que podría ser la causa del descenso de la
fijación de nitrógeno en las mismas. Ésta es
una de las conclusiones que ha presentado María Dolores
Gálvez en su tesis
defendida en la Universidad
Pública de Navarra. El trabajo
doctoral se titula: Metabolismo
nodular en Pisum sativum L. en respuesta a estrés
hídrico. Interacciones carbono/nitrógeno y posibles
moléculas implicadas en la modulación
de la respuesta.
Fijación de nitrógeno y
sequía
La fijación biológica de nitrógeno
es un proceso de gran interés
agronómico y ecológico, puesto que el
nitrógeno, después del agua y el
carbono, es el nutriente que limita en mayor medida el crecimiento
vegetal y la producción de los cultivos. Este proceso
resulta particularmente sensible a condiciones ambientales
adversas, como el estrés hídrico o sequía.
Precisamente el objetivo de la tesis doctoral
de María Dolores Gálvez ha sido investigar
cómo se produce la regulación de la fijación
biológica de nitrógeno en condiciones de
sequía.
La reducción del nitrógeno
atmosférico a amonio, o fijación de
nitrógeno, la llevan a cabo únicamente determinados
organismos procariotas. Entre ellos, los denominados
genéricamente rizobios son capaces de establecer simbiosis
con plantas leguminosas dando lugar a la formación de una
nueva estructura
radical: el nódulo.
Por un lado, la planta se beneficia del microorganismo,
que se encarga de tomar el nitrógeno del aire y
transformarlo en amonio de forma que se lo facilita a la planta.
Este amonio se incorpora a esqueletos de carbono para formar
aminoácidos y proteínas. Por su parte, el
microorganismo obtiene de la planta los nutrientes necesarios
para su crecimiento.
En condiciones de sequía, se detectó un
descenso de la actividad sacarosa sintasa nodular. Este descenso
se produjo simultáneamente al descenso de la
fijación de nitrógeno, pudiéndose establecer
una elevada correlación entre ambos procesos en
condiciones adversas. Como consecuencia de la inhibición
de la actividad sacarosa sintasa, se observó
también un descenso de la concentración de
azúcares fosfato y ácidos
orgánicos, lo que indica un descenso en el flujo de
carbono en los nódulos que limitaría, a su vez, el
suministro de carbono al bacteroide, viéndose afectada la
capacidad del bacteroide para fijar nitrógeno.
Percepción del estrés
hídrico
Con el fin de profundizar en el proceso de percepción
y transducción del estrés hídrico que lleva
a la inhibición de la fijación de nitrógeno,
María Dolores Gálvez estudió también
el ácido abscísico y las especies de oxígeno
activado como posibles moléculas implicadas en la
regulación de la fijación de
nitrógeno.
Los resultados obtenidos mediante la aplicación
exógena de ácido abscísico sugieren la
existencia de, al menos, dos mecanismos distintos de
regulación de la fijación de nitrógeno
dependiendo de cómo se desarrolla el estrés. En
situaciones en que el estrés se produce de forma gradual,
actuaría una ruta independiente de ácido
abscísico que implica la inhibición de la actividad
sacarosa sintasa y en situaciones en que el estrés se
produce de forma rápida e intensa, actuaría otra
ruta dependiente de ácido abscísico que implica un
control por leghemoglobina/oxígeno.
Para analizar la posible implicación de las
especies de oxígeno activado en la modulación de la
fijación de nitrógeno se recurrió a la
aplicación exógena de ácido
ascórbico, un antioxidante natural, en plantas expuestas a
estrés hídrico. El tratamiento con ácido
ascórbico exógeno realizado en condiciones de
estrés hídrico ejerció un papel beneficioso
sobre el contenido de proteína de la planta. Asimismo, se
observó una recuperación de la actividad total de
los enzimas del
metabolismo del carbono y nitrógeno en
nódulos.
Además, la aplicación de ácido
ascórbico no revirtió el efecto negativo del
estrés hídrico en la fijación de
nitrógeno, por lo que no es posible relacionar las
especies de oxígeno activado con la regulación de
la fijación de nitrógeno. En este contexto, el
descenso de la fijación de nitrógeno ocurre
asociado a una limitación en el flujo de carbono en los
nódulos, provocada por la inhibición de la
actividad sacarosa sintasa en dichas condiciones.
Por lo tanto, las señales
implicadas en la percepción y en la ruta de
transducción de señales que conduce al descenso de
la fijación biológica de nitrógeno en
condiciones de estrés hídrico son complejas y son
necesarios futuros estudios para comprender los mecanismos de
regulación de la fijación biológica de
nitrógeno.
El avance de las investigaciones
en los últimos 20 años ha sido muy importante, si
se considera la complejidad de los sistemas
enzimáticos involucrados, la fisiología del microorganismo en
relación con la producción de energía, las
características de la interacción microorganismo-planta y las
estrategias
seleccionadas en el proceso evolutivo para el control de la FBN.
La FBN a amonio es realizada únicamente por procariotes y,
en microorganismos con Nasas "convencionales", es un proceso muy
sensible al oxígeno. Por otra parte, el proceso de FBN es
un componente crítico en el ciclo global del
nitrógeno de relevante importancia ecológica. Los
mejores fijadores son los que establecen una simbiosis con
plantas superiores en la cual la energía para la FN y, en
general, el sistema de protección al 02 es proporcionado
por la planta. Dentro de los diazótrofos se incluyen los
asociados, de vida libre, simbióticos y
endófitos.
La FBN es el mecanismo principal de aporte de N en los
ecosistemas
naturales y es muy importante en la agricultura
del trópico. En varios suelos
tropicales, debido al bajo intercambio de iones y a la
mínima retención de agua de la fracción
mineral, la fertilidad del suelo está
estrechamente relacionada con el contenido de materia
orgánica del suelo. Como el N2 es el elemento más
fácilmente perdido cuando la mineralización de la
materia orgánica del suelo es estimulada por el arado del
suelo, es frecuente que este elemento controle la materia
orgánica del suelo y, por lo tanto, su fertilidad. La
aplicación continua de fertilizantes no puede ser una
opción sostenida para el tercer mundo, ya que los precios de los
energéticos son muy elevados, son contaminantes de los
mantos acuíferos y muchas veces son perdidos por
lixiviación.
El nitrógeno de la biósfera está
sujeto a un rápido recambio, y debido a que es perdido
como N2 a la atmósfera, su
mantenimiento
requiere de un continuo reemplazo con N reducido a partir del N2
atmosférico. La Nasa de S. Thermoautotrophicus
puede ser una enzima que esté distribuida en
microorganismos aislados de ambientes extremos, aspecto que no
había sido explorado con anterioridad y abre expectativas
alentadoras para la manipulación por ingeniería genética de este complejo
enzimático debido a su tolerancia hacia
el oxígeno, de tal manera que será relativamente
más sencilla su caracterización bioquímica, genética y
molecular.
Esta revisión reconoce el papel de la FBN como
una manera más efectiva, menos cara y no contaminante,
para mejorar la fertilidad del suelo comparada con otras
vías (como la fertilización química y la
orgánica), las cuales presentan altos niveles
de contaminación con metales pesados,
sales nitrogenadas y microorganismos patógenos para
el hombre. En
nuestro estado de
conocimiento
actual, tomando en consideración la producción
obtenida, la simbiosis Rhizobium-leguminosa es superior a
los otros sistemas FN; sin embargo, la
investigación reciente realizada con los
endófitos podría representar la mejor fuente de
fertilizantes "ideales", por lo que demandan un gran
interés como área de futura investigación.
Siguiendo otro camino, recientemente Bárbara
Rienhart y Thomas Hurec del Instituto Max Plack de Alemania,
afirman que han descubierto una bacteria, hasta ahora desconocida
(Leptocloafusca), que también fija nitrógeno y que
coloniza la raíz del arroz. La bacteria pertenece a un
nuevo género que
se ha llamado Azoarcus.
Según los investigadores, la planta de arroz
colonizada por esta bacteria crece entre un 10% a un 20%
más que las plantas control no colonizadas. Si ello se
confirma, significaría también que el proceso de
nodulación no estaría restringido sólo a las
leguminosas. Sin duda que ello es una buena noticia.
- González-López, J. Lluch, C.
Interacción planta- microorganismo: metabolismo del
nitrógeno. Ed. Rueda SL. Madrid.
1992. - Leigh, G.J. Nitrogen fixation at the millennium.
Elsevier Science. London, RU (2002) - Morot-Gaudry, J.F. Nitrogen assimilation by plants.
Physiological,biochemical and molecular aspects. Science
Publisher
Inc. Plymouth, RU, 2001. - Postgate, J. Nitrogen Fixation, Cambridge University
Press, Cambridge, RU, 1998. - Spaink, H.P., Kondorosi, A., Hooykaas, P.J.J. The
Rhizobiaceae, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Holanda.
1998. - Sprent, J.I. Nodulation in legumes. Royal Botanic
Gardens, Kew, RU. 2002. - Triplett, E.W. Prokaryotic Nitrogen Fixation, Horizon
Scientific Press, Wymondham, Norfolk, RU, 2000. - Leigh, G.J. The world's greatest fix: a history of
nitrogen in agriculture. Oxford University Press. 2004
.
Autor:
Blgo. Wilmer Paredes Fernández
Universidad Nacional de San Agustín
Arequipa – Perú – 2008.
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