- Conceptos básicos en
genética - Terapia
génica - Estrategias de terapia
génica - Aplicación de la
terapia génica - Terapia
génica: perspectivas futuras y
consecuencias - Referencias
- ¿Qué significa genética?
- CONCEPTOS
BASICOS EN GENETICA
- La genética es la rama de la biología que trata
de la herencia y la
variación. Esta disciplina
abarca el estudio de las células,
los individuos, sus descendientes, y las poblaciones en las que
viven los organismos. Los genéticos investigan todas las
formas de variación hereditaria así como las
bases moleculares subyacentes de tales
características.
- ¿Cuál es el centro de la
herencia de la
célula?
- Los organismos eucariotas se caracterizan por
la presencia de un núcleo en el que se encuentra el
material genético. En los procariotes, como las bacterias,
el material genético se encuentra en un área no
limitada pero reconocible, de la célula denominada nucleoide. En los
virus, que no
son auténticas células, el material
genético esta enfundado en una cubierta proteica
denominada cabeza o cápsula.
- DNA Y RNA son abreviaturas (acrónimos)
del ácido desoxirribonucleico y del ácido
ribonucleico, respectivamente. Son los dos tipos de ácidos
nucleicos que se encuentran en los organismos. Los
ácidos nucleicos junto con hidratos de carbono,
lípidos y proteínas, forman las cuatro clases
principales de biomoléculas orgánicas que
caracterizan la vida en nuestro planeta.
- El DNA, aunque tiene una sola cadena en algunos
virus, es normalmente una molécula de cadena doble
organizada en doble hélice. En las moléculas de
DNA se encuentran unidades hereditarias llamadas genes, que son
parte de un elemento más grande, el
cromosoma.
- En términos sencillos, gen es la unidad
funcional de la herencia. En términos químicos es
una cadena lineal de nucleótidos –bloques
químicos que constituyen el DNA y el RNA-. Una
definición más conceptual es considerarlo como
una unidad de almacenamiento de información capaz de sufrir
replicación, mutación y expresión. Es un
elemento muy complejo.
- En virus y en bacterias es más
fácil considerar al cromosoma como una molécula
grande, normalmente circular, de DNA, organizada en genes. En
eucariotas el cromosoma es más complejo. Esta compuesto
por una molécula de DNA lineal asociada a
proteínas. Además de la abundancia de genes, los
cromosomas
tienen muchas regiones no génicas. No esta claro el
papel que juegan algunas de estas regiones. El
conocimiento sobre los cromosomas, como de los genes, esta
en continua expansión.
- Si los cromosomas se liberan de la
cápsula vírica o de la célula bacteriana,
se puede visualizar al microscopio
electrónico. En los eucariotas los cromosomas son
visualizables más fácilmente en el microscopio
óptico, cuando están en meiosis o
mitosis.
En estos procesos de
división, el material que forma estos cromosomas
están fuertemente espiralado y condensado, dando lugar a
la característica de los cromosomas. Después de
la división, este material llamada cromatina, se
desespiraliza en la interfase y se puede estudiar mas
fácilmente con el microscopio
óptico.
- Aunque hay muchas excepciones, los miembros de
muchas especies tienen un numero especifico de cromosomas,
denominado el numero diploide (2n), presentes en una
célula somatica. Mediante un cuidadoso análisis, se ve que estos cromosomas
están en pareja, y cada miembro del par, cuando son
visibles en la división celular, comparte casi la misma
apariencia. Los miembros de cada par denominados cromosomas
homólogos, son idénticos en cuanto a su longitud
y a la localización del centrómero, el punto en
que se unen las fibras del huso en la
división.
También tienen la misma secuencia de
lugares génicos, o loci, y se aparean en la meiosis. El
numero de tipos diferentes de cromosomas de cualquier especie
diploide es igual a la mitad del numero diploide, que se
denomina el numero haploide (n). en algunos organismos como la
levadura , son haploides alo largo de la mayor parte de su
ciclo biológico y tienen solo una dotación de
cromosomas.
Muchos organismos, especialmente muchos
vegetales, se caracterizan por tener a veces mas de dos
dotaciones haploides de cromosomas y se dice que son
poliploides.
- Clásicamente, hay dos causas de la
variación genética: las mutaciones cromosomitas y
las mutaciones génicas o puntuales. Entre las primeras
también llamadas aberraciones cromosómicas, se
encuentra la duplicación, la delección y la
reordenación de segmentos de
cromosomas.
Las mutaciones génicas se producen por un
cambio en la
información química en el DNA,
que en conjunto se denomina el genotipo de un organismo. Tal
cambio puede ser una sustitución, duplicación o
delección de nucleótidos, que componen esta
información química. Las formas alternativas de
un gen que se produce como consecuencia de la mutación,
se denominan alelos. Frecuentemente, aunque no siempre, la
variación genética da lugar a l cambio de alguna
característica del organismo, denominada como
fenotipo.
Una vez que forma parte del repertorio
genético de un organismo, tal variante puede extenderse
por toca la población mediante diversos mecanismos
reproductivos.
- La secuencia de nucleótidos de un
fragmento de DNA que constituye un gen está presente en
forma de un código genético. Este
código especifica la naturaleza
química (la composición de aa.) de las
proteínas, que son el producto
final de la expresión génica. Se producen
mutaciones cuando se altera la secuencia de
nucleótidos.
- En el DNA hay cuatro nucleótidos
distintos, diferenciándose entre si por uno de sus
componentes, la base nitrogenada. El código
genético es un triplete; por consiguiente cada
combinación de tres nucleótidos constituye una
palabra del código, casi todos los posibles tripletes
especifican uno de los 20 aa., que son las unidades
químicas que forman las
proteínas.
- La información codificada en el DNA se
transfiere primero en el proceso de
trascripción a la molécula de RNA mensajero
(mRNA). Posteriormente el mRNA se asocia con un orgánulo
celular, el ribosoma, en donde se traduce una molécula
proteica.
- Sí, por ejemplo, los genes que modifican
el RNA ribosómico (rRNA), que forma parte del ribosoma,
y los del RNA transferente (tRNA), que actúan en el
proceso de traducción, se transcriben pero no se
traducen. Por consiguiente, a veces el RNA es el producto final
de la información genética
almacenada.
- La genética media toma parte de todas
las aplicaciones de la genética en la parte
médica. Por tanto, incluye los estudios de la herencia
de las enfermedades
en las familias, el mapeo (o trazado del mapa) de los genes
patológicos en sus localizaciones especificasen los
cromosomas, el análisis de los mecanismos moleculares
mediante los cuales los genes provocan la enfermedad, y el
diagnostico y el tratamiento de la enfermedad
génica.
Como consecuencia del rápido progreso de
la genética molecular, recientemente se ha iniciado la
terapia génica, que consiste en la inserción de
genes normales en pacientes con el fin de corregir enfermedades
genéticas. La genética médica
también incluye el asesoramiento genético, la
información de información relativa a los
riesgos, el
pronóstico y el tratamiento de sus pacientes y sus
familias.
- ¿Por
qué el conocimiento de la genética
médica es importante para el médico
actual?
- Primero porque las enfermedades
genéticas forman una gran parte de la carga
patológica total, tanto en la población
pediátrica como en la adulta. Esta proporción
continuara aumentando a medida que se incrementen nuestros
conocimientos sobre la base genética de las
enfermedades; y segundo porque la medicina
moderna esta poniendo énfasis creciente en la
importancia de la información y la genética
proporciona una base para el conocimiento de la constitución biológica fundamental
del cuerpo, alcanzando con ella de una forma natural un
conocimiento mas preciso del proceso patológico y en
muchos casos este conocimiento puede dar lugar a la
prevención real de la enfermedad, así como un
tratamiento mas efectivo de esta.
- Se calcula que cada ser humano tiene entre 50
mil y 100 mil genes diferentes. Las alteraciones de estos genes
o la combinación de estas puede producir trastornos
genéticos. Estas enfermedades se clasifican en varios
grupos
principales: 1) enfermedades cromosomitas, en las que se
pierden, duplican o alteran de alguna forma cromosomas enteros
o grandes segmentos de estos.
Esta enfermedad incluye el síndrome de
Down y el síndrome de Turner. 2) enfermedades
causadas por la alteración de un único gen (a
menudo denominados trastornos "mendelianos" o transtornos
por un único gen). Entre los Ej. conocidos se
incluyen la fibrosis quística, la anemia de
las células falciformes y la hemofilia. 3) transtronos
multifactoriales, originadas por una combinación de
causas genéticas múltiples y
ambientales.
A este tipo de enfermedades pertenecen muchos
defectos congénitos, como el labio leporino y/o la
fisura palatina, así como muchas enfermedades del
adulto, como cardiopatías y diabetes. 4)
transtornos mitocondriales, es un numero relativamente
escaso de enfermedades las ocasionadas por las pequeñas
alteraciones del cromosoma mitocondrial (probablemente de todos
estos tipos principales de enfermedades, sean los transtornos
por un único gen los que han recibido mayor atención; estos transtornos se clasifican
según el modo en que se heredan en las familias
–herencia autosómica dominante, herencia
autosómica recesiva y herencia ligada al sexo).
Mientras que algunos transtornos genéticos,
especialmente las enfermedades genéticas simples,
están muy determinadas por los genes, muchos otros
procesos son resultado de muchos factores genéticos y no
genéticos.
Podemos considerar que las enfermedades
genéticas se distribuyen a lo largo de un
continuum, con las enfermedades de la fibrosis
quística y la distrofia muscular de Duchenne situadas en
un extremo (muy determinadas por los genes) y las enfermedades
del tipo del sarampión situadas en el otro extremo (muy
determinadas por el entrono). La mayoría de las
enfermedades mas frecuentes, como muchos defectos
congénitos y enfermedades comunes como la diabetes, la
hipertensión, las cardiopatías y las
neoplasias, se sitúan en alguna parte del
continuum.
Estas enfermedades estarían causadas por
grados variables de
influencias genéticas y ambientales.
Algunas enfermedades se diagnostican con
más frecuencia en ciertos grupos étnicos. La
fibrosis quística es especialmente común entre los
individuos de raza blanca, mientras que la anemia de las
células falciformes es más común entre los
africanos.
Además, algunas enfermedades son mas
frecuentes en los ancianos, P. Ej. el cáncer
de colon, el carcinoma mamario y la enfermedad de Alzheimer
están causadas, en parte, por genes y no suelen
manifestarse hasta etapas tardías de la vida. La
prevalecía calculada de estas enfermedades seria superior
en una población mas envejecida.
El concepto de
terapia génica resulta de la observación de que ciertas enfermedades,
entre ellas particularmente el cáncer, resultan de
daños genéticos específicos (Felgner y
Rhodes, 1991; Anderson, 1992; Roemer y Friedman, 1992; Pyeritz,
1992; Kart y Broker, 1994; Friedman, 1996). En principio, las
patologías causadas por defectos monogenéticos
podrían ser curadas mediante la inserción y
expresión de una copia normal del gen
dañado.
La terapia génica se sustenta en la
tradición fármaco-quirúrgica de la medicina
y se define como la aplicación de principios
genéticos para el tratamiento de enfermedades humanas
(Wolf y Lederberg, 1994).
Concretamente el término terapia
génica unifica los principios de la farmacología
con los de la genética, pues implica tácitamente el
empleo de
ácidos nucleicos como el agente farmacológico para
el tratamiento de estados patológicos, con esto la terapia
génica persigue modificar el genoma de las células
somáticas transfiriendo copias normales de genes para que
produzcan cantidades adecuadas del producto génico normal,
cuya acción
corregiría la enfermedad
genética.
La estrategia
general que se utiliza para la terapia génica no es
más que una extensión de la técnica de
selección clonal por complementación
funcional. Primero, la función
ausente en el organismo recipiente como consecuencia de la
presencia de un gen defectuosos se introduce en un vector; luego,
este vector se inserta en uno de los cromosomas recipientes y
genera un organismo transgénico que se ha "curado"
genéticamente. Esta técnica tiene un enorme
potencial en los seres humanos porque nos ofrece la esperanza de
corregir los desordenes genéticos.
Aunque dentro de unos años
será posible mediante la terapia génica
reparar los errores que existen en un gen y causan la
enfermedad, los objetivos actuales son más modestos.
En primer lugar, la terapia génica trata de
complementar o sustituir el defecto en la función de
un gen defectuoso introduciendo otra copia normal de
éste en las células.Por otra parte, en otras situaciones lo que
se intenta es lo contrario, es decir, inhibir o bloquear el
funcionamiento de aquellos genes cuya intervención
contribuye al desarrollo de la enfermedad (por ejemplo los
oncogenes que intervienen en el cáncer o los genes
de virus que son necesarios para que estos se multipliquen
en las células).Por último, existen otras
posibilidades de acción de la terapia génica
en la que lo que se busca no es suplir o inactivar la
función de un gen, sino introducir la
información que permita a la célula
sintetizar una proteína que tenga un efecto
terapéutico nuevo. Este es el caso de la
transferencia de genes para estimular el sistema
inmune para que actúe frente a tumores o
enfermedades infecciosas, para que se acelere la
reparación de heridas, fracturas o se produzcan
nuevos vasos sanguíneos, etc.- Objetivos de la
terapia génica - Requisitos y
criterios para realizar estudios de terapia
génica
Evidentemente la meta de los estudios que
involucran la terapia génica como alternativa
terapéutica es la posibilidad de la utilización en
la clínica.
Para ello se requiere cumplir una serie de
requisitos que justifiquen estos medios y que a
continuación se mencionan:
- La patología no debe tener actualmente
un tratamiento efectivo para su cura. Para llegar a una
propuesta terapéutica sólida y
científicamente viable, se requiere de una fuerte
inversión en recursos
humanos y económicos por un tiempo
prolongado. Esto hace que el costo de una
o varias líneas de investigación que conduzcan a la
propuesta de alternativas terapéuticas para determinada
patología sea elevada. La inversión de estos
recursos debe
ser justificada cuidadosamente y, por ello, es conveniente que
la patología constituya un problema de salud
pública que no cuente con cura
actualmente. - Se debe conocer en lo posible los detalles del
efecto involucrado a nivel molecular. Es evidente que si se
pretende intervenir a nivel molecular, es indispensable contar
con el conocimiento detallado del efecto, o los
efectos. - Se debe tener un sustento científico
sólido que justifique la intervención a nivel
molecular. Para llegar a la aplicación clínica de
la terapia génica, se debe contar con amplia y
sólida evidencia científica que demuestre que la
intervención a nivel molecular podría resultar en
la mejoría de la salud el paciente, o en la
resolución del problema en cuestión. Esto se hace
evidente mediante la publicación de artículos
científicos que forman el marco
teórico que sustenta la intervención
molecular. Los protocolos
establecidos internacionalmente requieren de una secuencia
lógica que incluye desde la
comprobación de cambios celulares fenotípicos in
vitro, generados por el ácido nucleico
terapéutico en cuestión, así como la
comprobación de los efectos terapéuticos en
modelos
animales, la
caracterización toxicológica del procedimiento,
hasta llegar finalmente a la propuesta de su aplicación
en protocolos clínicos.
Las normas para
recibir terapia génica están bien establecidas e
incluyen varios requisitos:
- El gen debe estar aislado y debe estar
disponible para la transferencia, normalmente por clonación. - Debe haber un medio efectivo para la
transferencia del gen. Por el momento, muchos ensayos
utilizan vectores
retrovíricos, aunque también se emplean otros
métodos,
como los vectores adenovíricos y las técnicas
físicas y químicas. - El tejido diana debe ser accesible para la
transferencia genética. La primera generación de
procesos de terapia génica utiliza glóbulos
blancos o sus precursores como tejido diana. - No debe haber ninguna forma de terapia efectiva
disponible, y la terapia génica no debe dañar al
paciente.
Actualmente se están tratando varias
enfermedades hereditarias con terapia génica, como la
inmunodeficiencia combinada grave (SCDI, del ingles severe
combined inmunodeficiency), la hipercolesterolemia familiar, la
fibrosis quística y la distrofia muscular, y se
están desarrollando procesos para tratar otras
enfermedades.
III. ESTRATEGIAS DE
TERAPIA GENICA
En terapia génica se utilizan dos grandes
estrategias actualmente: las estrategias ex vivo (consiste en
extraer células de un paciente, modificarlas in vitro
mediante un vector retrovírico y reimplantarlas en el
organismo) y las estrategias in vivo (se trata de administrar el
gen corrector al paciente en lugar de hacerlo a células en
cultivo).
El tratamiento está basado en la
obtención previa de células del paciente
procedentes de un tejido u órgano de interés. A
continuación se procede a la disgregación de las
mismas y su mantenimiento
en condiciones de cultivo de tejidos in vitro,
en donde las células son posteriormente transfectadas por
el "gen terapéutico" utilizando para ello un vector
adecuado.
Las células transfectadas son seleccionadas
en función de su capacidad para expresar el gen
exógeno de forma estable y persistente. Las células
así seleccionadas son amplificadas y recolectadas con el
fin de ser reimplantadas al paciente.
También se puede utilizar líneas
celulares alogénicas en aquellos casos en los que el
órgano o tejido de interés no puede ser
extraído con facilidad o que ofrece dificultada in vitro.
El riesgo de rechazo
es mínimo y, por ello, es la técnica más
utilizada. Se usa fundamentalmente en el tratamiento de
cánceres.
- Químicos: Fosfato
cálcico. - Físicos: Electroporación,
Microinyección, Bombardeo de
partículas. - Fusión: Complejos ADN-liposomas.
- Endocitosis mediada por receptor: Complejos
ADN-proteína, Complejos ADN-cápsida/ envoltura
viral , Inmunoliposomas/liposomas
destinados.
- Adenovirus
- Retrovirus
- Virus adeno-asociados
- Herpes virus
El tratamiento está basado en
la
administración sistemática de la construcción génica de
interés. Aunque el ADN puede ser administrado de
forma directa lo habitual es recurrir a la ayuda de
algún vector que facilite el proceso de
transferencia del gen y permita la entrada y
localización intracelular del mismo, de tal forma
que éste resulte en un gen
funcionante.Así mismo, es importante recurrir a
vectores con destinos específicos dentro del
organismo lo cual permite la entrega celular selectiva del
gen en un determinado órgano o tejido, sin requerir
para ello procedimientos traumáticos o
quirúrgicos. Se emplea en células
difícil de extraer e implantar nuevamente, como
sucede en la mucoviscidosis.- Estrategias in
vivo
- Inespecíficos
- DNA desnudo
- Complejo DNA-liposomas
- Específicos
- Mediados por receptor
- Complejos
DNA-proteína - Inmunoliposomas/liposomas
destinados
- Retrovirus
- Adenovirus
- Virus adeno-asociados
- Herpes virus
3.3 Introducción del
transgén
Antes de explicar más detalladamente el
modo de introducción del transgén y ver las
enfermedades en las que se aplica la terapia génica, es
conveniente definir de forma clara qué es un
transgén, también denominado construcción
genética.
Podríamos definirlo como un conjunto de uno
o más genes y secuencias reguladoras que controlan la
expresión de éste. Este transgén es el que
tiene la función terapéutica, y es el que da la
terapia génica. Hasta el momento no se ha realizado
ninguna experiencia, a pesar de ser lo más idóneo
en un tratamiento, debido a su dificultad. Actualmente la
mayoría de las experiencias se están realizando en
modelos animales, pero también existen ya ensayos
clínicos en humanos.
3.3.1.1 Sistemas
químicos
A) Transferencia con fosfato de
calcio
Se empezó a usar esta técnica
en los años 60, pero fue en los 70 cuando se
empezó a desarrollar suficientemente para tener
buenas eficacias de transfección. Se basa en la
precipitación del DNA exógeno y los iones de
calcio, provocando que la célula, mediante
endocitosis, introduzca el DNA en su
interior.
La eficacia
de transfección puede llegar al 10% de las
células, aunque suele ser transitoria. No es una
técnica que provoque toxicidad en las células
pero la expresión del transgén es muy
pequeña. Únicamente se usa en cultivos
celulares, y por lo tanto su aplicación es "ex
vivo".
Consiste en colocar el DNA mediante una
inyección en el núcleo de las células.
Al introducirlo directamente allí, evitamos la
degradación citoplasmática y lisosomal. Se
realiza mediante un micromanipulador, microscopio invertido
que permite la visualización.Las células que sobreviven y han
insertado el material genético presentan una alta
eficacia de expresión del mismo. La técnica
es muy laboriosa y necesita células aisladas para su
realización. Este sistema se suele utilizar "ex
vivo". En el caso de inyección en embriones se
denomina terapia génica germinal siendo un método "in vivo".- Microinyección
- Electroporación
Se introduce la construcción
génica mediante un choque eléctrico a las
células que provoca la formación de poros en
sus membranas , por donde entra el transgén.
Está especialmente indicado para células con
una alta tasa de proliferación. Sin embargo, muchas
células mueren al no soportar el choque
eléctrico por lo que muchas veces no es la forma
más indicada en algunos tipos
celulares.
C) DNA desnudo
Consiste en la introducción del DNA en
una solución salina o sérica, normalmente
mediante inyección intramuscular, para conseguir la
expresión del transgén. Se ha observado
actualmente expresión en timo, piel,
músculo cardíaco y músculo
esquelético. No se conoce el mecanismo por el que
llega a entrar a la célula aunque se postula que es a
través del complejo del poro
nuclear.
Tiene un bajo porcentaje de células
transfectadas, no hay integración en el genoma y una vez
inyectado no hay replicación en el genoma. Este es un
sistema utilizado para la realización de la terapia
génica "in vivo".
3.3.2 Métodos
directos (mediados por vectores)
A) Liposomas
En 1965 se descubrió que los liposomas
(bolsas rodeadas de una membrana lipídica a semejanza
de una célula eucariota animal) eran capaces de hacer
entrar DNA en la célula, pero hasta 1980 no se
consiguió una eficacia de transfección
adecuada. Existen dos tipos de liposomas: liposomas
catiónicos y liposomas
aniónicos.
B) Liposomas
catiónicos
Se encuentran cargados positivamente por lo
que interaccionan con la carga negativa del DNA. Existen
muchos lípidos que se usan para formar estos liposomas
e incluso se están probando mezclas de
estos. Son recomendables en transfecciones "in
vitro".
Las ventajas de los liposomas es que protegen
de la degradación al transgén hasta su llegada
al núcleo. La talla del DNA introducido en ellos no
tiene límite. Podemos hacerlos llegar a tejidos
específicos incluyendo receptores en la capa
lipídica.
Sin embargo como desventaja presentan la baja eficacia de
transfección, una expresión transitoria, cierto
grado de toxicidad celular y pueden ser inhibidos por
componentes séricos.
C) Biolística o
Gene-gun
Consiste en el bombardeo de los tejidos con
partículas de oro o
tungsteno que llevan adheridas a ellas el DNA. El bombardeo
se realiza mediante una descarga con helio como si fuera una
pistola (de allí el nombre de la
técnica).
La capacidad de penetración es limitada
usándose en líneas celulares, epidermis,
músculo e hígado. Su expresión es
transitoria y en la zona de descarga se produce una gran
muerte
celular. Esta técnica puede realizarse "ex vivo" (en
el caso de células animales) e "in vivo" (en el caso
de células vegetales).
D) Vectores virales
Esta metodología comienza en 1968 cuando se
demuestra que los virus son capaces de infectar
células de mamífero. El desarrollo en 1989 de
las células empaquetadoras (aportan la
composición proteica que necesitan los virus para su
funcionalidad ya que ésta ha sido eliminada del genoma
viral) supuso un avance importante en esta metodología
al aumentar la titulación en virus no
patógenos. En todos los casos vamos a eliminar el
mayor número de genes y secuencias al virus para que
pueda captar el DNA exógeno. Los vectores virales
pueden ser utilizados tanto "in vivo" como "ex vivo". Hasta
el momento los virus más utilizados en terapia
génica son los siguientes:
- Retrovirus
Son virus ARN que tienen capacidad para
integrar genes terapéuticos relativamente grandes
(un máximo de 8 Kb). Necesitan de células
empaquetadoras para su obtención. Se transfiere el
DNA del virus mediante la técnica del fosfato de
calcio a las células empaquetadoras. Posteriormente
se realiza una segunda transducción en la cual
introducimos la construcción génica de
interés.
Los virus inyectados en el huésped
integran su DNA en el genoma del huésped expresando
así el gen que le hemos añadido. Como las
proteínas del virus no son expresadas por el
huésped, no tenemos una respuesta inmunitaria.
Tienen una alta eficacia de transducción y
también de expresión, siendo un sistema bien
estudiado.
Sin embargo, únicamente sirven para
infectar células del huésped que se
encuentran en división. Además los
títulos de virus obtenidos hasta ahora son bajos y
la integración en el genoma es al
azar.
Existen también vectores basados en
el virus del SIDA (HIV),
cuyo genoma es más complejo pero con un
funcionamiento similar al que hemos visto. Son los
denominados lentivirus.
- Adenovirus
Son una familia de
virus ADN que causan infecciones en el tracto respiratorio
humano. Se pueden llegar a insertar en ellos hasta 7.5 Kb.
de DNA exógeno. Normalmente en terapia génica
se utiliza el serotipo 5, aunque existen hasta 42 serotipos
diferentes que infectan a humanos.
En este caso no se necesita la
integración del material hereditario del virus en el
del huésped para su replicación, por lo tanto
tampoco el transgén será introducido en el
genoma de la célula. Y por tanto tampoco necesitan
que las células infectadas estén
dividiéndose para su
replicación.
La gran ventaja de usar un adenovirus como
vector es la alta eficacia de transducción, al igual
que la expresión de la construcción
génica introducida, sin embargo ésta es
transitoria (pocas semanas). Esto último
obligaría a tratamientos periódicos lo cual
es un inconveniente ya que los adenovirus producen
respuesta inmune celular e inflamatoria.
- Virus adenoasociados (VAA)
Son parvovirus, contienen DNA como material
genético, y requieren la coinfección con un
adenovirus para multiplicarse. Son vectores que combinan
las ventajas de los retrovirales y los adenovirales. Su
capacidad de integrar DNA exógeno es pequeña,
sólo de 5 Kb.
Las principales ventajas son que los virus
adenoasociados integran su DNA en la célula durante
la replicación, por lo que la transducción
(la cual es altamente eficaz) es estable en la
célula diana. Además pueden infectar tanto a
células en división como a las que no lo
están (de gran importancia para la terapia
génica "in vivo"). Los vectores AAV no están
implicados en ningún tipo de enfermedad humana.
Además el riesgo de una respuesta inmune está
minimizado ya que no produce proteínas
víricas.
Sin embargo existen también una serie
de inconvenientes como que este tipo de vectores
todavía no ha sido tan bien estudiado como los
retrovirus y los adenovirus.
- Herpesvirus
Son virus DNA cuyas células diana son
las neuronas. Su complejidad y lo poco que todavía
conocemos de esta familia de virus dificulta su
utilización.
La gran ventaja es el gran tamaño de
su DNA , que les permite aceptar varios genes
terapéuticos, incluso podrían ir con sus
propias regiones reguladoras.
Uno de los inconvenientes es que
habría que eliminar las secuencias que codifican
para las proteínas líticas del virus que
causan la
muerte de las células a las que
infectan.
Como resumen de los vectores, podemos hacer
una recopilación de las características que
deberían presentar para obtener el vector ideal para
su uso en terapia génica:
- Permitir la incorporación y expresión
regulada durante el tiempo conveniente, de uno o más
genes necesarios para la aplicación clínica
requerida
- Ser específico en su transferencia
génica
- Ser irreconocible para el sistema inmune y no
inducir respuesta inflamatoria
- Ser estable y fácil de
obtener
3.4.Otras estrategias
utilizando ácidos nucleicos
Como ya hemos visto la terapia génica
supone la manipulación de las células utilizando
procedimientos destinados tanto a reparar e incorporar nuevos
genes en la célula como también a bloquear e
inhibir la sobreexpresión de los mismos con fines
terapéuticos.
3.4.1
Oligonucleótidos antisentido
Los oligonucleótidos son secuencias
cortas de ácidos nucleicos diseñados para unirse
a secuencias específicas de ADN (formación de ADN
triplex) o ARN (formación de heteroduplex ARN-ADN). Los
oligonucleótidos antisentido son complementarios de
secuencias específicas de un determinado ARN mensajero
(secuencia sentido) .
La formación de un heteroduplex
bicatenario sentido-antisentido bloquea la traducción
del mensaje genético a proteína. Las estrategias
antisentido tienen un gran potencial terapéutico para
inhibir la expresión de genes en patologías tales
como el cáncer, enfermedades autoinmunes y enfermedades
infecciosas como el SIDA. Sin
embargo, su utilización en clínica se ha visto
limitada por su corta vida media en la circulación
sistemática y su dificultad para acceder con actividad
funcional al citoplasma y/o núcleo
celular.
Más adelante en el apartado sobre
aplicaciones sobre el cáncer se explicará este
tipo de estrategia con mayor
profundidad.
3.4.2 Reparación
genética mediante oligonucleótidos
Es una estrategia destinada a reparar genes cuya
alteración es originada por una mutación puntual
conocida y el objetivo es
activar selectivamente los mecanismos celulares de
reparación del ADN, el lugar de la
mutación.
Para ello se diseñan
oligonucleótidos específicos para secuencias
genómicas adyacentes al lugar de la mutación, en
cuyo extremo el oligonucleótido lleva un agente capaz de
lesionar el ADN , mediante la formación de un enlace
covalente con el nucleótido responsable de la
mutación . La lesión selectiva del
nucleótido mutado, desencadena el proceso celular de
reparación del ADN que conduce a una normalización estructural y funcional del
gen.
El término ribozima ha sido introducido
para describir moléculas de ARN con actividad
enzimática. Se ha identificado una enorme variedad de
motivos catalíticos de ribozimas, todos los cuales
catalizan reacciones en sustratos de ARN. Estas reacciones
llevan a cabo la rotura y ligación de las cadenas en
sitios específicos.
Una característica común para
todos los ribozimas es el requerimiento del ión de un
metal con carga divalente, como el magnesio Mg+2 ,
que participa en la reacción química. Diferentes
centros catalíticos de ribozima han sido incorporados en
ARNs antisentido, de tal forma que le dan la capacidad de
aparearse con un ARN diana que son sustratos para dichos
centros cortándolos en sitios específicos. La
actividad del centro catalítico de ribozima da el corte
y destrucción del ARN diana. Aparejando el ribozima con
el sustrato necesitaría poco tiempo para cortar el ADN
diana, inactivándolo funcionalmente.
Una vez que la diana ha sido cortada, el
ribozima puede disociarse de los productos
cortados y repetir el ciclo de unión , rotura y
disociación. La habilidad de los ribozimas para cortar
dianas y después reciclarlas proporciona una ventaja
sobre los ARN antisentido estándar; así
actúa estequiométricamente, y no destruye la
función del ARN diana.
Los ribozimas pueden ser producidos
química, bioquímica o biológicamente, y
algunas características de los
oligodesoxinucleótidos antisentido tales como
modificaciones químicas en la cadena o en las uniones
entre nucleótidos, pueden ser incorporadas dentro de la
molécula del ribozima sintético, así
añade estabilidad a la
molécula.
La especificidad de apareamiento de bases, puede
ser usada para dirigir los ribozimas a sus dianas, de ese modo
se sugirió desde etapas muy tempranas en el conocimiento
de los ribozimas que estas moléculas únicas
podrían ser creadas por ingeniería para reconocer o aparearse con
bases del ARN diana de cualquier célula o
virus.
Aunque se han hecho significativos progresos en
la ingeniería de ribozimas, todavía hay un
montón de cosas que deben ser aprendidas en orden para
optimizar la función del complejo de los ribozimas en el
comportamiento intracelular. Hasta estos
días, la mayoría de experimentos
intracelulares con ribozimas han sido llevados a cabo con los
ribozimas denominados "cabeza-martillo"
(hammerhead). De cualquier manera, otros
motivos de ribozimas, tales como los llamados
"horquilla" (hairpin),
comparte mucho de los mismos requerimientos básicos para
maximizar la eficacia intracelular. Así, la
aplicación con éxito
del ribozima "cabeza-martillo" debería proporcionar
valiosas lecciones para aplicaciones de otros motivos de
ribozimas.
La simplicidad del dominio
catalítico de "cabeza-martillo" lo ha hecho popular en
el diseño de ribozimas que actúan en
trans. Los requerimientos en el sitio de corte son
relativamente simples, y virtualmente cualquier UX (donde X es
U, C o A) pueden ser dianas, aunque la eficiencia de
la reacción de rotura varía entre diferentes
combinaciones.
Por otro lado una versión de
ingeniería del ribozima "horquilla", también
llamado "grapa", ha sido capaz de cortar y reciclar
múltiple variedad de dianas en trans. Aunque hay una
serie de cambios en el sustrato para este tipo de ribozima.
Entre éstos, incluye una G obligatoria junto al sitio de
rotura en el 3'. Por otro lado, hay bastante flexibilidad en
las combinaciones de secuencia guía-sustrato, lo que
hace que tenga un potencial éxito contra una amplia
variedad de ARN diana. Estos ARNs catalíticos son
relativamente simples y pueden ser construidos para esconder
secuencias que faciliten el apareamiento de bases frente a un
ARN deseado.
Hay cinco áreas de investigación
que podrían llevar a un aumento en la eficacia
intracelular de los ribozimas. Estos son:
- El reparto de ribozimas a células
apropiadas. - La eficiente expresión de los
ribozimas en estas células. - La co-localización de los ribozimas y
el sustrato de ARN diana en el mismo
compartimiento. - La especificidad de los ribozimas para
reconocer y cortar sólo la diana del sustrato de
ARN. - El aumento del reciclaje
del sustrato mediado por los ribozimas.
El primer ejemplo de terapia génica en
mamíferos fue la corrección de la
deficiencia en la producción de la hormona de crecimiento en
ratones. La mutación recesiva little (lit) produce ratones
enanos. A pesar de que estos presentan un gen de la hormona del
crecimiento aparentemente normal, no producen mRNA a partir de
este gen.
El primer paso en la corrección del defecto
consistió en la inyección en huevos lit/lit de unas
5 mil copias de un fragmento de DNA lineal de 5 Kb portador de la
región estructural del gen de la hormona del crecimiento
de la rata fusionado al promotor del gen de la
metalotioneína de ratón (MP). La función
normal de la metalotioneína es la destoxificación
de los metales pesados,
por lo que la región reguladora responde a la presencia de
metales pesados en el animal. Los huevos inyectados se
implantaron en hembras pseudopreñadas y se analizo la
descendencia.
Aprox. el 1% de los ratones recién nacidos
resultaron ser transgénicos, y aquellos a los que se les
administraron metales pesados durante el desarrollo alcanzaron
mayor tamaño.
En los mamíferos, el sitio de
inserción del DNA introducido es muy variable y no suele
encontrarse integrado en el locus homologo. Por ello, la terapia
génica en la mayoría de los casos no implica una
corrección genuina del problema original sino más
bien un enmascaramiento del mismo.
Se ha generado una tecnología similar
para generar variedades transgénicas de salmón del
Pacifico con una tasa rápida de crecimiento y los
resultados han sido espectaculares. Se microinyectó en
huevos de salmón un plasmado portador del gen de la
hormona del crecimiento regulado por el promotor de la
metalotioneína (ambos derivados del
salmón).
Una pequeña porción de los peces
resultantes fue transgénica, a juzgar por los resultados
positivos obtenidos por el escrutinio del DNA utilizando el
plasmado como sonda. Estos peces por termino medio pesaron 11
veces más que los controles no
transgénicos.
Quizás, la aplicación más
excitante y polémica de la tecnología de los
transgenes es la que respecta a la terapia génica humana,
es decir, el tratamiento y alivio de las enfermedades
genéticas humanas mediante la adición de genes
silvestres exógenos para corregir la función
defectuosa de las mutaciones.
En los seres humanos puede utilizarse dos tipos
básicos de terapia génica, la somatica y la
germinal.
4.2.1 Terapia en
células somáticas
La terapia génica en células
somatica, que ha sido el núcleo central de la
investigación de terapia génica en seres humanos,
consiste en la introducción de genes normales en
células somáticas humanas para tratar un
trastorno especifico. Las células del paciente pueden
extraerse y manipularse fuera del cuerpo (terapia ex vivo) o,
en algunos casos, las células pueden tratarse mientras
permanecen en el cuerpo (terapia in vivo).
Algunos tipos de células somáticas
son más apropiadas para la terapia génica que
otros. Los buenos candidatos deben ser fácilmente
accesibles y tener una vida media prolongada en el organismo.
En algunos sistemas de cesión genética son
preferibles las células en proliferación ya que,
en este caso, el vector portador del gen puede integrarse en el
interior del DNA de la célula.
No todos los tipos de enfermedades son
apropiadas para la terapia génica. Es probable que
muchas enfermedades dominantes, en especial las causadas por
mutaciones dominantes negativas, sean difíciles de
tratar porque requerirían de un bloqueo del efecto del
gen. La terapia génica alcanza sus objetivos con
más facilidad en las enfermedades recesivas que implican
la presencia de un producto genético defectuoso o
perdido. En este caso, la inserción de un gen normal
sustituiría al producto perdido.
Muchos trastornos recesivos de deficiencia
enzimática pueden corregirse, en potencia,
cuando se produce alrededor de 10% del nivel enzimático
normal.
Existen muchos posibles métodos de
introducción de genes en las células, incluyendo
la fusión
celular, la coprecipitación de fosfato cálcico
(el compuesto químico altera la membrana celular,
facilitando la introducción del DNA extraño), las
microinyecciones y la fusión de liposomas. Los dos
sistemas de cesión más utilizados son: los
retrovirus y los adenovirus.
Los retrovirus son capaces de insertar copias de
sus genomas en las células huésped después
de retrotranscribir su RNA viral en el DNA. Los retrovirus se
integran en el DNA del huésped con un lato grado de
eficacia, lo que los convierte en una opción razonable
como vector de cesión de genes. Los retrovirus deben ser
modificados para que no se repliquen ni afecten al
huésped. Esto se realiza utilizando técnicas de
DNA recombinante que provocan la delección de la mayor
parte del genoma retroviral, sustituyéndola por una
copia normal de un gen humano, sus elementos reguladores y una
señal de poliadenilacion (el material genético
humano se denomina "inserto"). Los retrovirus pueden aceptar
insertos de incluso 8 Kb.
Estos virus de replicación defectuosa se
propagan en células empaquetadoras (a veces, denominadas
células auxiliares) que compensan la maquinaria perdida
de reproducción de los retrovirus. Este
método permite la reproducción de
múltiples copias de retrovirus que contienen el gen
humano, pero que no pueden replicar a si
mismas.
A continuación, los retrovirus que
contienen las partículas se incuban con las
células somáticas del paciente (P. Ej. linfocitos
o células primordiales de la medula ósea humana).
Los retrovirus modificados insertan el gen humano normal en el
DNA de la célula huésped. De forma ideal, el gen
normal codificara después un producto génico
normal en las células somáticas del paciente.
Este tipo protocolo ha
tenido unos resultados iniciales favorables en el tratamiento
de la deficiencia de adenosina desaminasa.
Aunque la terapia génica retroviral es
muy prometedora, plantea varias dificultades:
- Expresión transitoria o de bajo nivel.
El producto génico puede expresarse en niveles
subterapéuticos, a menudo inferiores al 1% de la
cantidad normal. En parte, ello se debe a que tan solo
algunas células diana incorporan con éxito al
gen normal. Además, la inserción aleatoria del
retrovirus en el genoma del huésped puede afectar la
regulación del gen. La trascripción cesa a
menudo al cabo de algunas semanas o meses. - Dificultades para alcanzar el tejido diana.
Mientras que algunos transtornos sistémicos pueden ser
relativamente fáciles de tratar modificando linfocitos
o, quizá células primordiales de célula
ósea, otros plantean grandes dificultades. P. Ej. a
menudo es difícil alcanzar las neuronas afectadas
responsables de enfermedades del sistema nervioso
central. - Potencial de oncogénesis. Puesto que
los retrovirus se integran al azar en el DNA del
huésped, podría localizarse junto a un
protooncogen, activarlo y ocasionar así una
formación tumural. Para minimizar esta posibilidad se
alteran los promotores retrovirales; hasta ahora no se han
descrito otros casos directamente atribuibles a la
inserción de retrovirus. - Necesidad de una regulación precisa de
la actividad del gen. La regulacion precisa de la actividad
del gen no es necesaria en algunas enfermedades (P. Ej. una
expresión 50 veces superior de la adenosina desaminasa
no tiene efectos clínicos importantes). Sin embargo,
es fundamental para enfermedades como la talasemia, en la que
el número de cadenas de alfaglobina y betaglobina debe
ser muy equilibrado. Es difícil alcanzar una
precisión utilizando la terapia génica
retroviral. - Los retrovirus solo infectaran las
células en división activa. Esta propiedad
de los virus impide su utilización en células
que no se dividen o de división lenta (P. Ej. las
neuronas).
Se esta efectuando un gran esfuerzo de
investigación para superar estos problemas.
En especial, se están estudiando métodos de
inserción dirigida de genes y están desarrollando
técnicas que aumenten los niveles y la permanencia de la
expresión del gen.
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