Perspectiva para la fabricación de un Bionematicida a partir del hongo Pochonia chalmydosporia
- Resumen
- El Control Biológico
dentro de una agricultura sostenible - El control biológico
de nematodos formadores de agallas del género
Meloidogyne - Pochonia chlamydosporia como
agente de control biológico de
nemátodos - Limitaciones en el desarrollo
de bioplaguicidas a partir de hongos - Los sistemas de gestión
de la calidad y la producción - Bibliografía
La agricultura
actual demanda la
reducción de plaguicidas químicos y la introducción de sistemas
sustentables con el uso de agentes de control
biológico. La cepa Vcc-108 de Pochonia
chlamydosporia var. catenulata se reconoce como un
potencial agente de control biológico de nematodos
formadores de agallas, reduciendo la infestación de
Meloidogyne incognita en sistemas de
producción comercial en Cuba. Una
necesidad de la producción de bioplaguicidas
microbianos es contar con estudios de caracterización,
estabilidad, efectividad in vitro y en campo, estudios
toxicológicos, método de
producción y un efectivo sistema de
calidad que
garantice productos
seguros y
eficaces, de lo cual adolecen muchos sistemas de
producción de bajos insumos alrededor del mundo y que
deteriora la imagen de estos
productos. Se presentan los resultados fundamentales que
evidencian las perspectiva para la fabricación de un
Bionematicida a partir del hongo Pochonia chalmydosporia
Se aportan metodologías, referencias y conceptos que
pueden ser utilizadas por los productores de este tipo de
industria,
para la fabricación de bioplaguicidas seguros y
eficaces.
Palabras claves: Bionematicida, Pochonia
chalmydosporia, producción de bioplaguicidas
microbianos.
Uno de los problemas
fitosanitarios en el mundo y en Cuba, es la alta incidencia de
nemátodos formadores de agallas, especialmente
Meloidogyne incognita (Kofoid y White) Chitwood, que
provoca serias afectaciones en los rendimientos y la calidad de
la cosecha de cultivos de importancia económica (Castillo,
1988; Stefanova y Fernández, 1995). En este contexto, el
desarrollo y
aplicación de Agentes de Control Biológico (ACBs)
adquiere una importancia relevante como una alternativa
ambientalmente segura para el manejo de plagas en los programas de
producción diversificada de alimentos y la
reducción de plaguicidas químicos.
El control biológico de nematodos formadores de
agallas abarca una gran diversidad de organismos que viven en el
suelo,
informados como enemigos naturales de los nematodos que atacan a
las plantas. Entre
ellos se destacan la bacteria Pasteuria penetrans (Thorne)
Sayre y Starr sensu stricto Starr y Sayre y los hongos
Arthhobotrys irregularis (Matr.) Mekhtieva,
Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson y Pochonia
chlamydosporia (Goddard) Zare y W. Gams, siendo estos dos
últimos los más promisorios en el control de esta
plaga (Whitehead, 1997; Kerry, 2001).
En Cuba, Hidalgo y col., (2000), evaluaron aislamientos
autóctonos de P. chlamydosporia y seleccionaron a
la cepa Vcc-108 de P. chlamydosporia var.
catenulata (Kamyscho ex Barron y Onions) Zare y W. Gams
como potencial ACB de Meloidogyne spp., proponiendo un
método de producción masiva mediante
formulación sólida en bandeja, sentando las bases
para el desarrollo de productos eficaces y comercialmente
viables.
Atendiendo a las potencialidades de este hongo para el
control de nematodos formadores de agalla, se han precisado como
principales direcciones de trabajo la obtención de una
formulación comercial y la propuesta fundamentada de una
estrategia de
manejo, con la aplicación de cepas seleccionadas en
combinación con cultivos menos susceptibles o resistentes
a los nemátodos y que soporten un crecimiento extensivo
del hongo en su rizosfera (Kerry y Bourne, 1996; Atkins y col.,
2002; Kerry e Hidalgo, 2004).
El proceso de
obtención y comercialización de plaguicidas microbianos
ha estado
limitado por diferentes causas, informándose problemas con
la consistencia de las tecnologías productivas y de
productos con mala calidad, fundamentalmente en países del
Tercer Mundo (Jenkins y Grzywacz, 2000), y por tanto la poca
competencia en el
mercado de estos
productos microbianos (Whipps y Lumsden, 2001). Esta
situación debe ser revertida a partir de un estudio
profundo de cada elemento que interviene en la fabricación
y demostrada para cada ACB microbiano.
En el desarrollo de otras industrias, estos
problemas se han solucionados con la implantación de
Sistemas de Gestión
de la Calidad, y en el caso específico de las industrias
reguladas, como la farmacéutica, con la
implementación de Buenas Prácticas de
Fabricación (BPF), constituyendo la vía para la
obtención de productos seguros y eficaces, principios que
también caracterizan a los productos bioplaguicidas de
origen microbiano. Sin embargo, en la fabricación de estos
productos estas experiencias son muy limitadas y no se
señala la existencia de Guías de Buenas
Prácticas de Fabricación.
La práctica de establecer documentos de BPF
existe desde la década del 60 del Siglo XX en la industria
farmacéutica (OMS, 2003) y se ha convertido en un
método de amplio uso por todos los países del mundo
para las industrias reguladas, como la de alimentos. La
elaboración y aprobación de estos documentos se ha
extendido, de manera que constantemente se renuevan y se ajustan
dependiendo de los intereses de los productores y reguladores. En
la industria de los bioplaguicidas, aunque en determinados casos
se ha trabajado fuertemente y se han establecido principios de
aseguramiento de la calidad, como es en la cría de
insectos como controles biológicos (Leppla y col., 2002),
no se ha explotado ampliamente los conceptos de las BPF y esto se
ha hecho más deficitario en el caso de los bioplaguicidas
microbianos, lo cuales tienen su propia especificidad.
Cuba, al igual que otros países, cuenta con pocas
regulaciones para esta industria y solo recientemente se ha
establecido el registro de estos
productos. En los Centros para la Reproducción de Entomófagos y
Entomopatógenos (CREE) del país, se han estado
dando algunos pasos importantes para lograr un incremento de la
productividad
y calidad de sus producciones; identificando dentro de estas
investigaciones el desarrollo de sistemas de
control de la calidad más exigentes
(Fernández-Larrea, 2001), sin embargo, aún no
cuentan con un documento de BPF que les ayudaría en este
objetivo y
permitiría una organización apropiada y un lenguaje
común para estos procesos.
Los documentos de BPF deben diseñarse con los
requisitos mínimos necesarios para lograr de manera
sistemática productos de calidad. Por esta razón,
para definir estos documentos guías, primeramente se debe
identificar cuales son los aspectos propios de las producciones
de bioplaguicidas microbianos que resultan vitales para asegurar
estos resultados.
El ACB transita por varias fases para la
obtención de un producto que
pueda ser aplicado y comercializado, en estas fases se
desarrollan los resultados que a continuación presentamos
y que demuestran las perspectivas con este hongo en la
fabricación de un Bionematicida.
Desarrollo
Las Naciones Unidas
estiman que 2, 000 millones de personas en el mundo están
afectadas por enfermedades ocasionadas por
la desnutrición y el uso de sustancias nocivas
a la salud (FAO,
1995). Crear las condiciones para la producción de
alimentos seguros y el desarrollo de una agricultura sostenible
es una prioridad para los gobiernos e instituciones
internacionales, para lo que se requieren cambios
políticos y económicos (Dinham, 1996). La
definición de agricultura sostenible comprende la
dirección y conservación de los
recursos
naturales y la orientación de cambios
tecnológicos e institucionales de manera que aseguren el
logro y la satisfacción continuada de las necesidades
humanas para las generaciones presentes y futuras. Este desarrollo
sustentable en la agricultura, silvicultura y sectores de las
pesquerías, la tierra,
el agua,
recursos
genéticos de plantas y animales, debe
estar basado en técnicas
medioambientalmente no degradantes, económicamente viables
y socialmente aceptables (FAO, 1988).
La Agencia de Protección Ambiental de los
Estados Unidos
(EPA) define un Plaguicida como, cualquier sustancia o mezcla
de sustancias para prevenir, destruir, repeler o mitigar
cualquier plaga. Esta definición es bastante amplia,
pero tiene algunas exclusiones como son, las drogas usadas
para el control de enfermedades humanas o animales reguladas por
la Agencia de Drogas y
Alimentos de los Estados Unidos (FDA); fertilizantes, nutrientes
y otras sustancias usadas para promover la sobrevivencia y salud
de las plantas; productos que contienen ciertos ingredientes de
bajo riesgo, como
aceites de menta y ajo y los ACB, (EPA, 2001).
Entendiéndose como ACB a un enemigo natural,
antagonista o competidor u otra entidad biótica capaz de
reproducirse, utilizados para el control de plagas (FAO,
1999).
El control biológico de plagas a través de
la acción
de los ACB, contempla el fortalecimiento del control natural, la
introducción de especies no nativas y el uso de
plaguicidas derivados de animales, plantas, hongos, bacterias,
virus y
minerales para
prevenir, repeler, eliminar o bien reducir el daño
causado por las plagas (Carballo y Guaharay, 2004).
La segunda edición
del Manual de
Bioplaguicida, estableció cinco grupos de ACB y
dentro de ellos señala a los Microorganismos (virus,
bacterias, hongos, protozoos y
nemátodos), como importantes en el manejo integrado de
cultivos y agricultura orgánica como estrategias
convencionales en la protección de los cultivos (Cooping,
2001).
Actualmente estos productos representan apenas el 2% del
mercado mundial de plaguicidas. En los Estados Unidos a finales
del 2001 fueron registrados aproximadamente 195 ingredientes
activos y 780
productos clasificados como bioplaguicidas, estimándose
cerca de 72 bacterias, 47 hongos, 40 nemátodos y 2
protozoos (EPA, 2002).
De forma general el desarrollo de estos productos
transita por varias fases que comienza con el aislamiento del ACB
del ambiente;
estudios ecológicos, fisiológicos y
taxonómicos; demostrar efectividad por bioensayos de
laboratorios y campo; establecimiento del proceso de
producción masiva de un inoculo estable y sus costos;
formulación y efectividad en campo; estrategia de
aplicación; comercialización y por último el
programa de
manejo integrado donde va a ser utilizado (IBCD,
2001).
En Cuba, desde la década del 70 se producen y
aplican diversos bioplaguicidas microbianos, que actualmente
permiten cubrir más de medio millón de
hectáreas anuales en diferentes cultivos y contra varios
grupos de plagas (Fernández-Larrea, 2001).
Como una vía de diversificación, descentralización y producción
ecológicamente factible, en nuestro país se han
venido utilizando en los últimos años nuevas formas
de tenencia de la tierra y
producción, entre ellas la producción en
organopónicos y huertos intensivos comunitarios (Casanova,
1995) (Figura 1). En ellos se desarrollan programas de
producción de alimentos como: Programa de Agricultura
Urbana (hortalizas, arroz, viandas y proteína de origen
animal), y Programa de Agricultura Orgánica (vegetales,
miel de abejas, azúcar
de caña, cacao, café,
cítricos), entre otros (Hidalgo y col., 2002). En estos
últimos años las hortalizas frescas y de alta
calidad han tenido una demanda creciente por la población y el turismo.
Figura 1. Huerto intensivo de la comunidad de
Alamar. Ciudad de la Habana. Cuba.
La inmensa mayoría de los cultivos
hortícolas son buenos hospedantes de nematodos del
género
Meloidogyne, especialmente M. incognita, por lo que
éstos constituyen una de las más serias amenazas
para los sistemas de producción intensiva de hortalizas
(Stefanova y Fernández, 1995). De igual manera ocurre con
otros cultivos de importancia económica (Noe y Sikora,
1990), donde se informan pérdidas de alrededor del 10% de
la producción agrícola mundial (Whitehead, 1997) y
causan 80 mil millones de USD de pérdidas en los cultivos
cada año (Handoo, 2001).
1.2 El
control biológico de nematodos formadores de agallas del
género Meloidogyne
Los nematodos se clasifican en fitonematodos,
zoonematodos, nematodos entomopatógenos y nematodos de
vida libre (Stirling, 1991).
El control de fitonematodos se define como
tácticas específicas dirigidas a reducir o eliminar
poblaciones de nematodos, reservando el término manejo de
nematodos a los esfuerzos empleados para reducir el número
de nematodos por debajo del umbral de daño mediante el uso
de múltiples procedimientos de
control (Thomason, 1987).
Bridge (1996), propone cuatro estrategias para el manejo
de fitonematodos basado en el uso no directo de químicos,
métodos
culturales y físicos, uso del control biológico y
mantenimiento
de la biodiversidad
de los múltiples cultivos y cultivares que incrementan la
resistencia o
tolerancia de
los nematodos. Este mismo autor reconoce que a pesar de todos los
estudios relacionados con este tema, aún no se tienen
todas las respuestas para el control, en la práctica, de
los fitonematodos en sistemas agrícolas
sustentables.
El control biológico de nematodos formadores de
agallas abarca una gran diversidad de organismos que viven en el
suelo, que incluyen virus, rickettsias, bacterias, hongos
nematófagos, protozoos y tardígrados,
también depredadores como turbelarios, nematodos,
enchitridos, ácaros, collembolos y otros insectos (Kerry,
1995).
Dentro de ellos, las bacterias y los hongos muestran las
mayores potencialidades como ACB. Entre las bacterias se destaca
P. penetrans (Whitehead, 1997). En Cuba, recientemente se
ha informado a las cepas LBT-3 y C-924 de Bacillus
thuringiensis Berliner y Tsukamurella paurometabolum
(Steinhaus) Collins, Smida, Dorsch y Stackebrandt,
respectivamente, con posibilidades de ser empleadas como eficaces
bioplaguicidas (Mena, 2004). Entre los hongos encontramos a A.
irregularis, P. lilacinus y P. chlamydosporia,
siendo estos dos últimos los más eficaces en el
control de esta plaga (Kerry, 2001).
1.3 Pochonia
chlamydosporia como agente de control biológico de
nemátodos
Uno de los hongos nematófagos más
estudiados es P. chlamydosporia, considerado como uno de
los agentes de control biológico más promisorios
para el manejo de poblaciones de nemátodos formadores de
agallas (Kerry y Jaffee, 1997), en particular de huevos de M.
incognita (Kerry, 1987; Bourne, 1995; Hidalgo,
2000).
Los trabajos actuales con este agente están
dirigidos al aislamiento y selección
de cepas nativas y la obtención de formulaciones
comerciales (Hidalgo et al. 2004, Rivero y Campos, 1993;
Ciancio y Leonetti, 1999). También se propone estudiar
estrategias de manejo de poblaciones de nemátodos
agalleros con la combinación de la aplicación de
las cepas seleccionadas y cultivos menos susceptibles o
resistentes a los nemátodos, que soporten un crecimiento
extensivo del hongo en su rizosfera (Kerry y Bourne, 1996; Bourne
y Kerry, 1999; Atkins y col., 2002, Kerry e Hidalgo,
2004).
Para hacer realidad la viabilidad productiva de este
hongo como agente de control biológico, es necesario
trabajar en la búsqueda de métodos que permitan la
producción de un gran número de clamidosporas,
estructura que
facilita al hongo establecerse en el suelo y sobrevivir cuando el
número de nemátodos es escaso. Otras fases del
hongo no pueden competir con la microflora del suelo y por
consiguiente requieren de suplementos nutritivos (Kerry y col.,
1993).
Este hongo crece fácilmente en un rango amplio de
cultivos, in vitro, pero no produce clamidosporas en
fermentaciones líquidas sumergidas (Kerry y col., 1986).
La producción de clamidosporas es posible en medios
sólidos, pero sus rendimientos son bajos para una
explotación comercial (Montes de Oca, 2004, Kerry y
Bourne, 1996).
Diferentes proyectos de
investigación se desarrollan para viabilizar este
empeño, pero aún en la práctica
agrícola no se utilizan productos a partir de este
hongo.
1.3.1 Descripción de Pochonia
chlamydosporia
P. chlamydosporia (ex Verticillium
chlamydosporium Goddard) es un Deuteromycete, parásito
facultativo de huevos de nemátodos de quistes y agallas
ampliamente distribuido en el mundo. Aparece como parte de un
complejo de diferentes especies estrechamente relacionadas (Zare
y col., 2000).
La identificación de esta especie comienza en
1913, cuando Goddard aisló de suelo de jardín a un
hongo que identificó como V. chlamydosporium. Hace
cerca de tres décadas, Gams (1971) redescribió el
género Verticillium y propuso una nueva
sección, Prostrata, para incluir aquellos hongos
sin conidióforos erectos bien definidos. Esta
sección abarcó, fundamentalmente, a
patógenos de invertebrados originalmente ubicados en el
género Cephalosporium. Balazy (1973) no estuvo de
acuerdo y conservó las especies con fiálides
verticiladas en Cephalosporium. Esta clasificación
no ha sido generalmente aceptada (Carmichael y col. 1980) y
subsecuentemente, Gams y van Zaayen (1982) propusieron dos nuevas
secciones, Nigrescentia y Albo-erecta, acomodando a
las especies patógenas de plantas y fungícolas,
respectivamente.
La controversia sobre la ubicación
taxonómica de este género, es el resultado de la
imposibilidad de reconocer la diversidad genética
dentro de este grupo (Rowe,
1995). Por tal motivo, Gams y colaboradores desarrollaron una
serie de estudios morfológicos y moleculares clasificando
las especies de este género en cuatro grandes grupos (A,
B, C y D) teniendo en cuenta el rango de hospedante, ubicando en
el grupo D a los hongos parásitos de huevos de
nemátodos y quistes, típicos en producción
de dictioclamidosporas (Zare y col., 2000; Zare y col.,
2001).
Posteriormente, Sung y col., (2001) realizaron estudios
sobre las secuencias nucleotídicas de pequeñas y
grandes subunidades nucleares del ADN ribosomal
(ADNr) de especies representativas del género
Verticillium considerados dentro del grupo D y definieron
tres linajes, incluyendo al hongo nematófago V.
chlamydosporium en el D2, estableciendo que la
mayoría de las especies de Verticillium sec.
Prostrata son miembros de la familia
Clavicipitaceae. Finalmente, las observaciones y análisis filogenéticos de las
pequeñas y grandes subunidades del ADNr, 5.8S y la
región ITS (Internal Transcribed Spacer)
permitieron reubicar a las especies de hongos parásitos de
huevos y quistes de nemátodos y que forman clamidosporas
(V. chlamydosporium) en el género
Pochonia (Gams y Zare, 2001).
Para este género y las especies incluidas estos
autores informan las siguientes
características:
Colonias de rápido crecimiento con 15-40 mm de
diámetro de la colonia en 10 días.
Conidióforos usualmente postrados y pequeñas hifas
diferenciadas, algunas veces erectas. Fiálides verticiladas o
solitarias. Conidios de forma subglobosa, elipsoidal a bacilar.
Producen dictioclamidosporas sobre la superficie de la colonia o
en el agar sumergido. Cristales
ausentes.
Para la especie se han informado los siguientes
sinónimos:
Verticillium chlamydosporium (Goddard,
1913)
Stemphyliosis ovorum (Petch, 1939)
Diheterospora heterospora (Kamyschko,
1962)
Pochonia humicola (Batista y Fonseca,
1965)
Dictyoarthrinopsis kelleyi (Dominik y
Majchrowicz, 1966)
Diheterospora chlamydosporia (Barron y Onions,
1966)
Otro aspecto que ha resultado controversial en esta
especie, es la definición de las taxas
chlamydosporia y catenulata, como especies
separadas o como variedades de una misma especie. Debido a que la
principal diferencia entre ellas lo constituye la
disposición de los conidios en las fialides en cadena
(catenulata) o en falsas cabezas
(chlamydosporia).
Gams (1988) valoró
que estas diferencias tienen un limitado peso y no siempre pueden
definir, por si solos, entre los aislamientos, por lo que propuso
considerar a chlamydosporium y catenulatum como
variedades de una misma especie, V. chlamydosporium. Este
criterio lo mantuvo Gams y Zare, (2001) al reubicar esta especie
en el género Pochonia.
El nombre del género anterior de esta especie es
compartido con patógenos importantes de planta como
Verticillium dahliae (Kleb.) y Verticillium
albo-atrum Reinke y Berthold, por lo que renombrarlo
favorece los procesos de registros y de
aplicación en el campo de este hongo como ACB (Montes de
Oca, 2004).
1.3.2 Mecanismo de acción de P.
chlamydosporia
P. chlamydosporiaparasita huevos de nematodos
formadores de agallas formando apresorios, desarrollados a partir
de la hifa indiferenciada que permite la colonización de
la superficie de los huevos de los nematodos (Morgan-Jones y
col., 1983). Sin embargo, la penetración, es el resultado
de una presión
física y
una actividad enzimática. Una enzima proteasa serina
alcalina (subtilasa) designada como VCP1 ha sido parcialmente
caracterizada y en pruebas in
vitro demostró remover la membrana vitelina más
externa de la cáscara del huevo y expuso la capa de
quitina de nematodos formadores de agallas de raíces
(López-LLorca y Robertson, 1992; Segers y col.,
1996).
Se piensa que VCP1 pudiera explicar el rango de
hospedante o de virulencia. Diferentes aislamientos de P.
chlamydosporia difieren marcadamente en la producción
de esta enzima y en la capacidad de parasitar los huevos en
simples pruebas en placas Petri con agar (Kerry, 2001).
Recientemente Morton y col., (2003) secuenciaron el gen que
codifica para la producción de VCP1 y demostraron estas
diferencias. Enzimas similares
han sido identificadas en otros hongos nematófagos
(López-LLorca, 1990; Segers y col., 1999).
En general, todos los aislamientos infectan huevos
inmaduros más ágilmente que a huevos maduros. Los
juveniles de segundo estado escapan a la infección a
temperaturas cercanas a 30ºC, porque eclosionan antes que la
masa de huevo sea totalmente colonizada y los nematodos en fases
móviles no son parasitados por el hongo (Kerry y Bourne,
2002). Por lo tanto, es necesario seleccionar el aislamiento para
la plaga blanco específico y las condiciones en las cuales
este podría ser aplicado
Este aislamiento coloniza raíces, suelos y parasita
huevos en porcientos Peteira et. al, 2004, Montes de Oca,
2004.
1.3.3 Estudios de la especie P. chlamydosporia
en las condiciones de Cuba.
El primer informe de la
presencia de esta especie en Cuba es publicado por Cabrera y
col., (1987) al encontrar a P. chlamydosporia colonizando
masas de huevos (ootecas) de M. incognita en guayaba.
Posteriormente Hidalgo y col., (1998), informan la presencia de
las dos variedades (chlamydosporia y catenulata)
parasitando huevos de M. incognita en el cultivo del
tomate en la
provincia de la Habana y en suelos cafetaleros de Santiago de
Cuba.
Estos estudios se continuaron, informándose
posteriormente más de 80 aislamientos con una gran
variabilidad específica e Inter.-específica en este
género, notificando la presencia de tres especies y dos
variedades: P. chlamydosporia var. chlamydosporia
(Goddard) Zare y G. Gams; P. chlamydosporia var.
catenulata; P. suchlasporia var. catenata
(W. Gams y Dackman) Zare y W. Gams y Lecanicillium
psalliotae (Treschow) G. Gams y Zare (Hidalgo y col.,
2000).
En sentido general, los aislamientos cubanos presentaron
gran producción de clamidosporas, mayor intensidad en la
coloración de las colonias, con predominio de colores
ocráceos, sobre todo la variedad catenulata, al ser
comparadas con las descripciones realizadas por Gams
(1988).
En el propio estudio Hidalgo y col., (2000) describieron
que algunos aislamientos de la variedad catenulata
presentaron características peculiares no informadas
anteriormente, como son la producción de clamidosporas
inusualmente grandes y escasas sobre pedúnculos
generalmente cortos y ensanchados cerca del tope y la presencia
de conidióforos erectos, con fiálides ligeramente
más cortas y ensanchadas en la base. Estos aislamientos
fueron considerados como un nuevo biotipo, denominado como P.
chlamydosporia var. catenulata biotipo A.
Entre todos los aislamientos estudiados por este autor,
se seleccionó a la cepa Vcc-108 de la var.
catenulata como la más promisoria con un 68% de
huevos de M. incognita parasitados en condiciones
semicontroladas y el 70% de las masas de huevos colonizadas sobre
la rizosfera del tomate, después de seis meses de aplicado
el hongo en una sucesión de cultivos (Atkins y col.,
2003).
(Cortesía del Dr. Leopoldo
Hidalgo-Díaz)
Con esta cepa se han desarrollado metodologías de
reproducción masiva en bandejas mediante
formulación sólida (Hidalgo, 2000), y
posteriormente mediante una tecnología de
Fermentación en Estado sólido en
Bolsa (FESB), la que permitió obtener mayores rendimientos
y desarrollar ensayos de
campo a mayor escala en las
áreas agrícolas del CENSA (Hidalgo y col., 2004).
En estos ensayos de campo se ha demostrado que con una sola
aplicación del hongo a razón de 5000 clamidosporas
por gramo de suelo, después de dos ciclos consecutivos de
tomate este logra infestar más del 60% de los huevos
expuestos en la rizosfera, reduciendo significativamente el
número de juveniles en el suelo (Peteira y col.,
2004).
Estos resultados sientan las bases para una posterior
optimización de la producción, formulación y
registros de productos bionematicidas a partir de esta
cepa.
1.3.4 Métodos para el aislamiento,
identificación y estudio del potencial de P.
chlamydosporia
Para la identificación morfológica de
P. chlamydosporia, el uso de técnicas
microscópicas es el método más utilizado en
la actualidad; pero precisa de gran cantidad de tiempo y de
personal
altamente experimentado en el estudio de cada aislamiento (Atkins
y col, 2002), y ha resultado inexacto para la ubicación
taxonómica de los hongos en general. Tanto el uso de
medios de cultivos, como la observación macro y microscópica de
los caracteres morfológicos para la identificación
de las diferentes especies nematopatógenas de
Pochonia, resultan engorrosos por las pequeñas
diferencias morfológicas entre ellas (Kerry y col., 1995;
Bourne y col., 1996).
Esto hace necesario la búsqueda de métodos
más sensibles y rápidos para su detección,
utilizándose entonces las técnicas moleculares que
explotan la variación en los genes del ADN ribosomal o
mitocondrial (White y col., 1990) y que son sensibles, factibles
y más rápidas que los métodos convencionales
para identificar cepas de hongos incluyendo a Pochonia
(Morton y col., 1995).
Ensayos basados en la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR) fueron desarrollados para diferenciar la
diversidad de la secuencia ITS presentes en diferentes especies
de Verticillium (Nazar y col., 1991; Robb y col., 1993;
Moukhamedov y col., 1994). Particularmente, Arora y col. (1996)
lograron diferenciar aislamientos de P.
chlamydosporia de otros hongos del suelo.
Posteriormente, una secuencia parcial del gen β tubulin de
los hongos fue obtenida, facilitando el desarrollo de un ensayo por
PCR para el diagnσstico específico de
la variedad chlamydosporia a partir de material de planta
infestado con el nemátodo y propágulos del hongo en
el suelo (Hirsch y col., 2000).
Para el
conocimiento de las interacciones tritróficas entre el
hongo la planta y el nemátodo se hace necesario visualizar
el hongo in situ, es por ello que se estudia la
aplicación de aislamiento de hongos que contengan genes
marcados o el uso de anticuerpos monoclonales (Hirsch y col.,
2001). Sistemas de transformación de P.
chlamydosporia se han descrito para viabilizar estos objetivos
(Atkins y col., 2000). Recientemente se desarrolló un
ensayo por
PCR-competitivo para su cuantificación en el suelo
(Mauchline y col., 2002).
Los métodos desarrollados hasta el presente,
tienen la limitante de no poder informar
sobre el estado
fisiológico del hongo y de no ser específicos para
detectar aislamientos de la variedad catenulata. Por lo
que se necesita profundizar en el estudio de estas
técnicas antes de ser usadas como instrumentos para la
caracterización y detección de diferentes
aislamientos de P. chlamydosporia.
Para el aislamiento y estimación de la
concentración de P. chlamydosporia en el suelo o
sobre la raíz se estudiaron diferentes medios de cultivos
(de Leij y col., 1992), que resultaron ser inefectivos
(Nadakavukaren y Horner, 1959; Menzies y Griebel, 1967 y
Christen, 1982). Solo un medio semiselectivo desarrollado por
Kerry y col., (1993), logró distinguir las colonias de
esta especie del resto de la microflora del suelo.
Estableciéndose como el mejor método de
cuantificación a la combinación de dilución
y conteo en medios selectivos (Butterfield & DeVay, 1977;
Gaspard, y col., 1990; Kerry y col., 1993). Sin embargo, tienen
la limitante de no detectar el hongo por debajo de 500
Unidades Formadoras de Colonias (UFC) por gramo de suelo y
de que el número de UFC detectadas es muy superior al
número de clamidosporas aplicado, teniendo en cuenta que
tanto fragmentos de hifas como conidios pueden dar lugar a una
colonia.
Figura 3. Crecimiento de la cepa IMI SD: 187 a los 21
días de incubación a 25ºC en medio
Semiselectivo.
Una relación de estudios sobre la
caracterización cultural, morfológica y
diferenciación molecular realizados con la cepa IMI SD
187, son parte de los indicadores de
calidad que garantizan la identidad y
pureza de la cepa e inoculo utilizado en los procesos de
fabricación y aplicación en campo (Montes de Oca,
2004).
Para caracterizar el potencial de este hongo en el
suelo, se necesita conocer su relación cuantitativa con
respecto a la rizosfera de la planta y a la plaga (Waage y
Greathead, 1988). La estimación de los cambios en la
densidad del
hongo precisa de técnicas de extracción
física de clamidosporas del suelo (Crump y Kerry, 1981) y
de la estimación del número total de
propágulas en el suelo o en raíz (Kerry y col.,
1993). Sin embargo estos métodos solo son capaces de
detectar cambios relativos en la abundancia del hongo y no se
pueden relacionar con su actividad.
Para la determinación de la producción de
clamidosporas a partir de muestras de suelos, se han explorado
ensayos de centrifugaciones con la ayuda de sulfato de magnesio y
de tinciones, después se aplican métodos de conteo
de células al
microscopio
óptico, como el uso de la cámara de Neubauer. Con
este método algunas veces se dificulta la
identificación de las clamidosporas, por la interferencia
de otras partículas que están presentes en el
suelo, con el inconveniente de que es un proceso que consume
tiempo. El método varía con el tipo de suelo, el
cultivo y los tratamientos (Kerry y Bourne, 2002).
Estos mismos autores refieren que el parasitismo de
huevos de nematodos por P. chlamydosporia, se ha
establecido como el método de rutina para evaluar la
actividad biológica. El cual se basa en la siembra del
hongo en placas Petri con medio de cultivo, donde se enfrentan
huevos del nematodo y el hongo, determinando el porcentaje de
parasitismo. En este método la dificultad estriba en la
extracción de los huevos de las masas logrando la
concentración deseada, sin que se afecte la pared del
mismo, práctica que influye grandemente en la calidad del
ensayo. Otros métodos se han utilizado, pero todos
concluyen con este procedimiento.
Con la utilización de este método se han
obtenido valores de 68%
de parasistismo in vitro y controlado en macetas para la cepa
Vcc-108 (IMI SD 187) de P. chlamydosporia (Montes de Oca,
2004), en experimentos de
campo se informan porcentajes sueperiores al 70% (Kerry e
Hidalgo, 2004).
Para la estimación de poblaciones de nematodos en
el suelo, se utiliza el método de extracción por
bandeja, que es simple, rápido y puede utilizarse gran
cantidad de muestras de suelos. Otros ensayos, solo permiten el
uso de pocas cantidades de suelo como el de flotación y
esto hace que la muestra no sea
representativa (Whitehead y Hemming, 1965).
La estimación de las poblaciones de nematodos en
raíces puede ser de diferentes formas: masa de huevos por
gramo de raíz, huevos por masas de huevos, % de huevos
infectados y el número de adultos y juveniles en el
sistema de la raíz.
Se conoce que la planta hospedante tiene efecto directo
e indirecto sobre el crecimiento del hongo en la rizosfera. En
general las plantas difieren en su habilidad para soportar el
crecimiento del hongo y este es más abundante sobre
raíces infectadas por nematodos comparadas con aquellas no
infectadas, no está claro, si el incremento en la densidad
del hongo resulta de la colonización directa de la masa de
huevos o de la liberación de nutrientes en la rizosfera.
En la interpretación de los resultados de estos
métodos, es imprescindible tener en cuenta los niveles de
presencia del nematodo, el tipo de cultivo y en general las
interacciones tritróficas que se establece entre el hongo,
la planta y la plaga (Kerry, 2001).
Diferentes grupos de investigadores en el mundo
desarrollan novedosos bioensayos y combinaciones con
métodos clásicos para el aislamiento,
identificación, detección y monitoreo de esta
especie como elemento esencial para dilucidar el papel de las
variaciones del hongo en la regulación de las poblaciones
de nemátodos.
La obtención de cebadores específicos ha
permitido la identificación y diferenciación de la
variedad chlamydosporia, así como de otros hongos
del suelo (Atskins et al., 2003). Estos métodos
moleculares unidos a medios de cultivos específicos para
este hongo, fortalecen el control de la calidad de la cepa y para
la vigilancia post aplicación del producto bionematicida
(Montes de Oca, 2004)
En la actualidad se continúa con el desarrollo de
metodos más precisos y factibles que faciliten el estudio
de los aislamientos de esta especie con potencialidades como ACB
de nematodos formadores de agallas.
1.3.5 Métodos para el mantenimiento y
conservación de las capacidades de P.
chlamydosporia como ACB.
Para asegurar la viabilidad, estabilidad y consistencia
del ACB o de los productos que se deriven, lo primero es
seleccionar el método de conservación y los
procedimientos de manejo y vigilancia adecuada para conservar las
características originales por las que fue
seleccionado.
En el caso de la especie P. chlamydosporia se han
utilizado varios métodos para su conservación,
algunos de tiempo corto que involucran la conservación del
hongo sobre agar cubierto con agua o
aceite mineral
a 4ºC. Estos métodos son relativamente
rápidos, fáciles y no requieren de equipamiento
especial. Sin embargo, no siempre el hongo logra sobrevivir por
largos períodos de tiempo en estas condiciones (Kerry y
Bourne, 2002).
La colección de P. chlamydosporia de la
Estación Experimental de Rothamsted (Reino Unido)
han sido conservados por más de 5 años sus
aislamientos por los métodos de liofilización,
crio-preservación y en subcultivos sobre medios agarizados
a 4ºC. De igual manera Hidalgo (2000), estableció los
métodos de subcultivo y liofilización para la
conservación de la colección de Pochonia y
Verticillium conservadas en el Centro Nacional de Sanidad
Agropecuaria (CENSA).
El subcultivo es un método sencillo y utilizado
tradicionalmente para la preservación de microorganismos,
el cual consiste en la transferencia del hongo a un medio de
cultivo fresco a intervalos que aseguren su viabilidad. Estos
intervalos varían dependiendo de las
características del microorganismo
en cuestión. Esta frecuencia puede reducirse con el
almacenamiento
del subcultivo a temperaturas relativamente bajas, a
40C o entre –100C y
–800C, bajo aceite mineral o agua (Snell,
1991).
A pesar de las ventajas asociadas al uso de este
método, hay que tener presente la posibilidad de perder el
microorganismo por el riesgo de contaminación y de cambios genéticos
que se incrementa a mayor número de transferencias; la
posible inoculación con el microorganismo equivocado
cuando se trabaja con muchas cepas a la vez y la
deshidratación del medio de cultivo; entre otros (Smith y
Onions, 1994).
Uno de los efectos que puede ocasionar la transferencia
periódica del cultivo, es la formación de zonas con
características diferentes al resto del micelio y cambios
en la capacidad para producir metabolitos secundarios y enzimas.
Estos sectores son frecuentes durante el crecimiento de colonias
de hongos mitospóricos en medios agarizados y en ellos se
observan diferencias en sus características culturales y
morfologicas, que pueden ser ausencia de esporulación,
entre otras (Grendle, 1964; Gramss, 1991; Kim, 1997; Ryan y col.,
2002).
Autores como Prosser (1993) concluyen que este
fenómeno puede resultar de un crecimiento atípico a
través de mecanismos que no están aún bien
explicados. Kirn y col., (2001) describieron la formación
de sectores como una "mutación". También se han
informado aislamientos de hongos que no han tenido cambios en
sucesivos subcultivos (Hall, 1980) o que pases a través
del hospedero pueden mejorar la virulencia y expandir el rango de
hospedante (Aizawa, 1971; Ferron, 1985).
El otro método de conservación más
utilizado es la liofilización, el cual varia sus
condiciones con las características
físico-químicas del medio de suspensión, el
tipo de microorganismo, el estado fisiológico del cultivo,
las condiciones del cultivo y la concentración de los
microorganismos, entre otros (Sly, 1992). En el caso de P.
chlamydosporia se usan como medio de suspensión el
Caldo Nutriente suplementado con glucosa al
7.5% (Kerry y Bourne, 2002). Este método es uno de los
más eficaces para la conservación de muchos tipos
de microorganismos, como: bacterias, hongos, bacteriófagos
y virus; algunos de ellos pueden sobrevivir por períodos
de más de 40 años. Sin embargo, el proceso es
complejo y caro, pues requiere de un equipo de
liofilización, por lo que no se puede aplicar en
laboratorios con recursos limitados (Smith y Onions,
1994).
La mayoría de los métodos de
preservación logran reducir el ritmo metabólico de
los organismos por retención de nutrientes, agua y
oxígeno; por reducción de la
temperatura de
conservación; o por combinación de ambos. Ellos
tienen una tendencia inherente a mutar en cultivos de laboratorio,
por lo que es muy importante el uso de procedimientos para
vigilar y asegurar su viabilidad y estabilidad genética
(Sly, 1992). Las propiedades conocidas del microorganismo deben
chequearse periódicamente y siempre que sea posible,
aquellas que puedan variar en el tiempo (Smith, 1996).
Las colecciones de cultivos deben desarrollar programas
de investigación para determinar y asegurar la
estabilidad de las cepas, requisitos exigidos por los
órganos de registros (FAO, 1988; EPA, 1996; OECD, 1996 y
CNSV, 2001b).
En sentido general los protocolos de
estabilidad deben evaluar periódicamente las
características culturales, morfológicas, de
viabilidad, pureza, identidad, velocidad de
mutación, cambios enzimáticos o moleculares de las
cepas, entre otros, para cada método de
conservación. Estos estudios aportan información necesaria para obtener la
licencia de investigación, desarrollo, producción y
aplicación de los ACB y aseguran la continuidad de los
productos.
1.4 Limitaciones
en el desarrollo de bioplaguicidas a partir de
hongos.
Dentro del grupo de bioplaguicidas de origen microbiano
se destaca el uso de los hongos como agentes de control
biológico por su amplio número de géneros y
especies eficaces en el control de diferentes plagas, pero pocos
se han logrado producir y aplicar de forma estable y masiva
(Goettel y col., 2001).
De igual manera existe un número considerable de
hongos antagonistas de fitonemátodos con potencialidades
para el control biológico, y un gran interés en
su aplicación (Duncan, 1991). Sin embargo, ninguno es
ampliamente usado en la práctica agrícola (Kerry y
Jaffee, 1997; Whitehead, 1997; Fravel, 1999), debido
fundamentalmente al deficiente conocimiento
entre otros aspectos de: modo de acción, producción
de metabolitos y eventos o
condiciones que afectan su actividad como bioplaguicida (Mena y
col., 1996; López-LLorca y Olivares-Bernabeu,
1998).
Para la aplicación de estos productos, se
necesitan grandes volúmenes de fermentaciones, que a su
vez son procesos de bajos rendimientos y altos costos de
producción (Jackson, 1997), y en la mayoría de
los casos tienen poca consistencia (procesos repetibles) y baja
estabilidad (Jenkins y col., 1998), debido al poco desarrollo de
métodos de producción masiva adecuados, estudios de
escalados y formulación (Fernández-Larrea, 2001),
entre otros.
A pesar de todas las limitaciones referidas, en el mundo
numerosos grupos de investigadores y empresas
productoras se concentran en el desarrollo de productos
comerciales a partir de hongos entre los que se citan: Biofox C
(Fusarium oxysporium Schlect y Fusarium moniliforme
Sheldon, SIAPA, Italia), Mycotal
(Lecanicillium lecanii (Zimmerm) Zare y Gams, Koppert,
Holanda), Mycotrol GH (Bauveria bassiana (Bals) Vuill,
Mycotech, EUA), Green Muscle (Metarhizium flavoviride Gams
y Rozsypal, CABI Bioscience, Reino Unido), entre otros (Burges,
1998; Butt y Copping, 2000).
Dentro de los bioplaguicidas con efecto nematicida se
encuentran entre otros DiTera (Myrothecium verrucaria
Ditm., Valent-Sumitomo, EUA-Japón),
(Burges, 1998; Butt y Copping, 2000). El PAECYL, PL PLUS, BIOACT
o Nemacheck, (P. lilacinus, Filipinas-Australia) (Holland,
2001).
En Cuba están en proceso de registro productos
como el HeberNem (T. paurometabolum, CIGB Camaguey)
(Mena y col., 2002) y el KlamiC (P. chlamydosporia, CENSA)
(Hidalgo, 20041), con resultados alentadores en el
control de M. incognita.
Se puede resumir que las limitaciones, son de orden
técnica, de registro y comerciales, logrando avanzar
aquellos ACB que tienen una alta velocidad de acción,
persistencia, tolerancia, mecanismo de acción definido,
estudios de seguridad
(Toxicología y Ecotoxicología), un
mercado viable y una demanda basada en el número de plagas
o enfermedades que controla, así como costos eficientes de
producción (Powell y Faull, 1989).
Se añaden a estas limitaciones la poca
utilización de sistemas de gestión de la calidad
con la aplicación eficiente de estos conceptos en las
diferentes fases de desarrollo de estos productos.
Por tanto, para viabilizar esta alternativa dentro de
las estrategias de manejo de plagas es necesario un ímpetu
significativo para mantener el interés y resultados
concretos que se han ido materializando en productos seguros y
eficaces como estrategia sostenible para nuestra
agricultura.
1.4.1 Tecnologías de producción
de hongos ACB
De forma general en la fabricación de
bioplaguicidas a partir de hongos se busca la producción
apropiada de inóculos, formulación y
aplicación de tecnologías apoyados en un control de
la calidad efectivo (Whipps y Lumsden, 2001).
Una de las etapas más difíciles de vencer,
es la obtención de una tecnología de
producción masiva a gran escala, que permita cantidades
suficientes de un inoculo de calidad que sea consistente y
compatible con la propuesta de formulación y
aplicación (Jenkins y col., 1998).
Se reconocen varias tecnologías de
producción; las más usadas para hongos son a partir
de soportes sólidos (Fermentación en Estado
Sólido-FES), en cultivos líquidos sumergidos
(Fermentación Líquida) o combinaciones de ambos
(Fermentación Bi-Fásica) (Nagel, 2002). Estos
métodos generalmente se consideran artesanales o
semiartesanales atendiendo al número de manipulaciones que
involucran. Cada método tiene ventajas y desventajas, lo
más importante es la calidad del producto final y su
factibilidad
tecnológica y económica (Fernández-Larrea,
2001).
1 Dr. Leopoldo Hidalgo. Especialista de control
biológico de nematodos. Protección de Plantas,
CENSA. Cuba (Comunicación Personal)
Lo primero es contar con un buen aislamiento que
mantenga su virulencia y homogeneidad (Shieh, 1989) y a partir de
aquí desarrollar el sistema de producción, para lo
cual se necesita conocer los requerimientos de nutrición, pH, actividad
del agua, contenido de humedad en el sustrato, temperatura
óptima de crecimiento y esporulación, influencia de
la luz, aire, entre otros
(Johnpulle, 1938; Barlett y Jaronski, 1988; Latgé y
Moletta, 1988; Kleespies y Zimmermann, 1992).
Muchos trabajos optimizan estos parámetros a
pequeña escala en frascos Enlermeyer, que generalmente
producen gran cantidad de datos, pero no
son repetibles al aumentar la escala productiva. Una razón
para esto es que aumenta el volumen de
sustrato y por tanto los niveles de aireación son
más difíciles de mantener, aparecen problemas
físicos en las operaciones de
esterilización y las técnicas asépticas son
difíciles de asegurar (Jenkins y col., 1998).
Estos autores también plantean que la
fermentación bifásica tiene la ventaja de expresar
los contaminantes del cultivo patrón, facilitando la
colonización y conidiación y reduciendo el tiempo
de incubación.
Los requerimientos para el sustrato depende de varios
factores: factibilidad local, costo,
preferencia del aislamiento, hidratación y
esterilización. Se pueden usar sustratos no nutritivos o
nutritivos. Estos últimos tienen alta concentración
de contaminantes (Jenkins y Lomer, 1994).
La producción de esporas tiene un requerimiento
especial en cuanto a la tolerancia a la desecación, lo que
puede estar asociado a las condiciones nutricionales durante el
crecimiento del cultivo y la esporulación. Por tanto, la
optimización del sustrato para la producción masiva
no solo actúa sobre el rendimiento, sino también
sobre la calidad de la espora (Jackson, 1997).
Otros elementos como la aireación mejoran la
velocidad de la esporulación y ayudan a remover los
excesos de calor. Estos
sistemas deben usar aire estéril y húmedo para
evitar introducir contaminaciones y desecación prematura
del sustrato (Bradley y col., 1992 y Guillon, 1997).
El contenido óptimo de humedad depende de la
relación hongo-sustrato, este elemento tiene un papel
significativo en el rendimiento y su optimización es
complicada. Los rangos del porcentaje de agua en el sustrato
húmedo se encuentran entre 35 y 60% (Moo-Young y col.,
1983). La temperatura y la luz varían con el tipo de
microorganismo (Thomas y Jenkins, 1997).
La mayoría de los procesos productivos que
utilizan el sistema bifásico se componen de operaciones de
inoculación, incubación, secado y
extracción. Evaluando parámetros productivos y de
calidad como: el rendimiento (# de conidios producidos/g o Kg
de sustrato, calculado como el valor promedio sobre el
número de ciclos de producción),
concentración de conidios en el producto final (# de
conidios producidos/g o Kg de producto final), capacidad de
manejo del sustrato (# de Kg de sustrato usado en cada
lote, calculado como el promedio sobre el número de
lotes), salida (# máximo de lotes posibles por
año). Los controles de calidad mínimo que se
recomiendan son: identidad, estabilidad y pureza del cultivo
patrón, monitoreo de la
contaminación durante el proceso, concentración
de contaminantes viables totales, viabilidad de la espora y la
virulencia/patogenicidad del producto. Otros pueden ser
contenidos de agua, cantidad de ingrediente activo/g de producto
y el tamaño de la partícula. (Cherry y col.,
1999).
Otros elementos a tener en cuenta son los datos
económicos de cada lote y el conocimiento de la dosis de
aplicación en el campo (Cantidad o # de g de producto
aplicado por hectárea o por área tratada) (Jenkins
y col., 1998).
Cada elemento que interviene en la fabricación
requiere de un grupo de condiciones y requisitos que deben ser
bien estudiados y demostrados para cada aislamiento,
método productivo y escala. En todos los casos, es
necesario contar con un método de conservación
adecuado para la cepa y estar reconocido en una colección
con depósito seguro y acceso
no autorizado. Tener establecido una tecnología con la
presencia durante todas las operaciones de los controles de
proceso y los de calidad del producto final expresados en las
especificaciones y la implementación de un efectivo
sistema de calidad que abarque los elementos de la
preproducción y post aplicación del
producto.
1.4.2 Problemática en Cuba en la
producción de hongos bioplaguicidas
En Cuba a partir del año 1959 se impuso un nuevo
orden social que revolucionó la agricultura (Oppenheim,
2001). En la década del 80 se implementó con mayor
fuerza el
manejo integrado de plagas como estrategia para la
reducción de plaguicidas químicos (Rego y col.,
1986), incrementándose el uso de los bioplaguicidas
(Rosset y Bourque, 2001). Años después se crean los
CREE para la producción artesanal de ACBs y la
comercialización a cooperativas
agrícolas y campesinos privados (Pérez y
Vázquez, 2001), lo que le ha permitido al país
contar con recursos propios en un campo tan importante como la
protección fitosanitaria de los cultivos
(Fernández-Larrea, 2002).
Numerosas investigaciones se han conducido en la
producción, formulación, control de la calidad y
aplicación de numerosas bacterias y hongos que incluyen a
B. thuringiensis, B. bassiana, Metarhizium
anisoplae (Metsch.) Sorok, L. lecanii y Trichoderma
harzianum Rifai (Global Exchange Delegation Members, 1996;
Fernández-Larrea, 2004).
Estas pequeñas producciones se realizan con bajos
insumos y facilidades mínimas instaladas y su uso es
limitado a regiones pequeñas. Cuentan con el Manual de
métodos para la producción de entomófagos y
entomopatógenos (INISAV-CNSV-MINAGRI, 1991) y normas y
programas para realizar el control de la
calidad. Hasta hace
poco tiempo estos biopreparados no requerían ser
registrados, por lo que las exigencias eran mínimas para
su obtención y aplicación.
A partir de la prioridad del gobierno de
estimular esta estrategia se han dado pasos importantes como son:
la definición, dentro del Programa de Biotecnología Agrícola, del tema de
investigación "Obtención y Desarrollo de
Bioplaguicidas, Biofertilizantes, Biorreguladores y Extractos
Naturales", y la aprobación de la Guía para el
Registro de los Plaguicidas Microbianos (CITMA, 1995; CNSV,
2001b).
El Comité Asesor del Registro de Plaguicidas
Microbianos (CNSV, 2001a) evaluó los principales problemas
para lograr la implementación de esta guía, dentro
de los que definió: pobre definición de las
formulaciones y formas finales del producto; poca
información sobre el mecanismo de acción; no se
expresan los métodos y precauciones sobre la
manipulación, almacenamiento y transportación de
los productos; no se hacen ensayos para demostrar que el producto
está exento de patógenos humanos; no se expresan
los procedimientos de descontaminación y limpieza de
equipos, entre otros.
Lo que sostiene, que además de faltar
información técnica, que se obtiene en las fases de
investigación-desarrollo, las fabricaciones adolecen de la
experiencia en el diseño
e implementación de los conceptos de calidad, no aplicando
BPF, aspecto que debe ser abordado en la producción de
bioplaguicidas en Cuba.
La calidad y el desarrollo
económico crecen íntimamente ligados,
creándose una carrera por el perfeccionamiento de los
productos y servicios, a
tal punto que muchos países consideran a la calidad como
un objetivo nacional, siendo el mayor cambio que
deben experimentar en el futuro todas las naciones (Villoch,
1998). Para llevar una organización al éxito
se requiere que esta se dirija y controle de forma
sistemática y transparente, logrando implementar y
mantener un sistema de gestión que esté interesado
en una mejora continua de su desempeño considerando las necesidades de
todas las partes interesadas (NC ISO 9000,
2000).
La norma cubana NC ISO 9000:2000
describe los fundamentos y vocabulario aplicables a los sistemas
de gestión de la calidad. Los conceptos de calidad
aplicados en este trabajo son
tomados de dicha norma.
En ella se define como Gestión a las
actividades coordinadas para dirigir y controlar una
organización. La gestión de una
organización comprende la gestión de la calidad,
recursos
humanos, financieros, rentabilidad,
medio
ambiente, seguridad y salud
ocupacional entre otras disciplinas. La integración de estos aspectos en el sistema
de gestión de la
organización puede facilitar la planificación, la asignación de
recursos, el establecimiento de objetivos complementarios y la
evaluación de la eficacia global
de la misma.
En general, los principales planteamientos de la
Gestión de la Calidad radican en que la calidad no es una
función
técnica, ni un departamento o programa de conciencia, sino
un proceso sistemático, ligado al cliente, que se
debe poner en practica total y rigurosamente en la
compañía entera, integrando a los suministradores
(Feigenbaum, 1991).
La Calidad es el grado en el que un conjunto de
características inherentes cumple con los requisitos,
entendiéndose por Característica a un rasgo
diferenciador que puede ser inherente o asignado, clasificada
como: físicas, sensoriales, de comportamiento, de tiempo, ergonómicas y
funcionales. Y como Requisitos de la Calidad a la necesidad o
expectativa establecida, generalmente implícita u
obligatoria, los que permiten la evaluación y el
control de las necesidades de mercado, el cliente, de relaciones
contractuales, de desempeño, disponibilidad,
mantenimiento, fiabilidad, además de las de seguridad en
el uso, para la sociedad y el
medio ambiente.
Para el diseño de
sistemas de gestión de la calidad, se ha elaborado la
familia de
Normas ISO
9000. Dentro de ellas, la ISO 9001 debe
aplicarla aquella organización independiente de su tipo o
tamaño que necesite demostrar su capacidad para
proporcionar productos que cumplan los requisitos de sus clientes y los
regulados para ella, la que puede complementarse con la ISO 9004
(mejora continua) y la ISO 19011 (auditorias),
entre otras (NC ISO 9000, 2000).
Estas normas no especifican los requisitos para el
producto, el que puede definirse por el cliente, la propia
organización o por disposiciones reglamentarias. Los
requisitos para los productos y en algunos casos los procesos
asociados pueden estar contenidos en especificaciones
técnicas, normas de productos, normas de proceso, acuerdos
contractuales y requisitos reglamentarios. Se define como
Producto al resultado de un proceso el que se entiende
como conjunto de actividades mutuamente relacionadas que
interactúan, las cuales transforman elementos de entrada
en resultados.
Para lograr calidad, que conlleve la satisfacción
del cliente a través de un enfoque de proceso, es
necesario realizar en la empresa una
Gestión de la Calidad que generalmente incluye el
establecimiento de la política y objetivos,
la planificación, el control, el aseguramiento y la mejora
de la calidad (Juran, 1993; NC ISO 9000, 2000)
La Planificación de la Calidad está
enfocada al establecimiento de los objetivos de la calidad y a
la especificación de los procesos operativos necesarios y
de los recursos relacionados para cumplir los objetivos de la
calidad. El Control de la Calidad es la parte orientada al
cumplimiento de los requisitos de la calidad. El
Aseguramiento de la Calidad, es la parte de la gestión de
la calidad enfocada a proporcionar confianza en que se
cumplirán los requisitos de la calidad y la Mejora de
la Calidad, es para aumentar la capacidad de cumplir con los
requisitos de la calidad. (NC ISO 9000:2000)
La aplicación de estos conceptos describe los
componentes que deben incluir los sistemas de gestión de
la calidad, pero cada organización tiene libertad para
diseñarlos y aplicarlos según sus condiciones
específicas. Se convierte en una clave para el
éxito de un negocio, porque permite elevar la
productividad, reducir los costos e incrementar las ventas y los
beneficios, en un mundo donde el cliente está en la
posición de escoger.
1.5.1 Aplicación de conceptos de
calidad a la industria de Bioplaguicidas
Las industrias que generan productos que intervienen
directamente en la seguridad de los consumidores han estado
sometidas a un fuerte control estatal, para demostrar la
seguridad y confiabilidad de sus producciones,
conociéndose como industrias reguladas (Lauzan, 1996).
Así surgió en 1962 el primer documento de Buenas
Practicas de Producción (BPP) en la industria de
producción de medicamentos, que no es más que una
recopilación de los requisitos mínimos de
aseguramiento de la calidad para este tipo de industria (CECMED,
2000).
No debe desconocerse que con el desarrollo de la
tecnología y los conocimientos del hombre, otras
industrias pueden irse incorporando en este grupo expresamente
controlado por los Estados. Las tendencias indican que las
producciones de bioplaguicidas están en esta vía,
pues son productos que pueden influir en la seguridad del
ambiente y el hombre. Sin
embargo, a pesar de que se han ido estructurando regulaciones
para el otorgamiento de licencias de fabricación (Bode,
1997; Hamer, 1997), aún se informan insistentemente
dificultades con algunos de estos productos, lo que no permiten
un amplio uso (Kerry, 2001).
Ocurre que muchos de ellos están catalogados por
el mercado como débiles por su baja eficacia y
cuestionable control de la calidad, lo cual influye en la pobre
imagen de la industria de bioplaguicidas (Harris, 1997; Foster,
2001). En la mayoría de los países del Tercer Mundo
que fabrican bioplaguicidas para el control de
plagas, tienen dificultades en la consistencia y calidad de
sus productos finales porque no se aplican sistemas que aseguren
su calidad (Jenkins y Gzywacz, 2000).
Considerando las condiciones que implican por una parte
la
globalización del mercado mundial y las necesidades de
las producciones agrícolas de nuestra
economía
nacional, el establecimiento de sistemas de
calidad en las producciones en este sector se constituyen en
una actividad estratégica.
Es significativo que, en las experiencias que se han
señalado en estas producciones, no se encuentra que hayan
explotado la posibilidad de establecer guías de Buenas
Prácticas, aunque se ha señalado el uso de las
Buenas Practicas de Laboratorio (BPL) (FAO, 1988; EPA, 1996;
OECD, 1996 y CNSV, 2001b), lo que indica que tampoco hay claridad
en la concepción y origen de estos conceptos. Las BPF son
regulaciones que recogen los requisitos mínimos
recomendados para lograr producciones eficaces y seguras (CECMED,
2000; OMS, 2003) y dentro de ellas se encuentra el cumplimiento
de las BPL.
La implementación de una guía de BPF para
la producción de bioplaguicidas, tiene la ventaja de
establecer requisitos generales que puedan ser asumidos por una
gran diversidad de procesos productivos y por otra parte,
establece pautas que son una plataforma adecuada para lograr
producciones de calidad. La estructuración de las BPF se
considera un primer paso para llegar a un Sistema de
Gestión de la Calidad (cecmed, 2000).
Una característica esencial de la
producción de cualquier ACB es contar con un eficiente
control de la calidad, porque ayuda a maximizar la eficiencia del
producto, estandarizar los costos de producción y lograr
consistencia a través de ciclos productivos repetibles.
Sistemas que están fuera de control pueden obtener
productos con concentraciones variables del
principio activo, riesgos para
la salud del consumidor y por
tanto la perdida de confianza por el cliente (Jenkins y Grzywacz,
2000).
El Aseguramiento de la Calidad consiste en garantizar
que todas las operaciones de la producción sean
reproducibles y logren resultados similares en cada lote. Como
parte del Aseguramiento de la Calidad, la norma cubana NC ISO
9001 (2000) plantea algunos elementos esenciales como son:
garantizar el establecimiento de un proveedor que suministre las
calidades especificadas de las materias primas y materiales, la
calibración de todos los medios de medición, el manejo adecuado de las
materias primas, la capacitación y preparación del
personal, el establecimiento de los controles de proceso, el
control del comportamiento del producto una vez aplicado,
además de las evidencias
documentadas de las operaciones realizadas, entre
otros.
En los controles establecidos se debe definir los
métodos de control y los criterios de aceptación
(NC ISO 9001, 2000). Los rangos o límites de
los puntos de control se pueden establecer teniendo en cuenta las
regulaciones, trabajos científicos, estudios realizados en
la propia planta de producción o de datos
históricos de los procesos productivos (Inda, 1999),
apoyados en las herramientas
del control
estadístico de la calidad (Montgomery y Klatt, 1972;
Shewhart, 1980; ISO, 1995).
En estos momentos, debido a las pocas regulaciones
dirigidas a esta industria en el mundo, el establecimiento de las
especificaciones de calidad de cada bioplaguicida depende de lo
definido por cada empresa
productora (Jenkins y Grzywacs, 2000). De forma general el
control de la calidad del producto final debe responder a dos
elementos claves: la seguridad y eficacia.
Como se ha planteado, la aplicación de un sistema
de Gestión de la Calidad es útil para cualquier
tipo de organización y de producciones, por lo que si la
industria de bioplaguicidas asume estos conceptos se
beneficiaría de todas las ventajas descritas
anteriormente. Sin embargo, no se refieren muchas experiencias en
el ámbito mundial de su aplicación, por el
contrario abundan los casos de producciones con dificultades en
la consistencia de sus procesos y producto final que
mejorarían sustancialmente con la aplicación de un
Sistema de Gestión de la Calidad.
Demostrar que sistemas de bajas tecnologías
productivas en países en desarrollo pueden obtener
productos de calidad, partiendo de la implementación
adecuada de conceptos de calidad, es una estrategia necesaria
para una agricultura sostenible.
En este sentido se estableció una
tecnología de producción insertada dentro de un
Sistema de Gestión de la Calidad para la
fabricación de un producto nombrado KlamiC que ha
demostrado ser efectivo y seguro.
A partir de todos los estudios y resultados obtenidos se
cuenta hoy con un producto fitosanitario (KlamiC) a partir de la
cepa Vcc-108 de Pochonia chlamydosporia var
catenulata efectivo y seguro para el control de nematodos
agalleros y de una tecnología transferible para la
reproducción de otros hongos ACB.
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Datos del autor
Nivian Montes de Oca* PhD,
Doctor en Ciencias Agrícolas, Investigador
Auxiliar de la Dirección de Calidad del Centro nacional de
Sanidad Agropecuaria (CENSA). Carretera de Jamaica y autopista
Nacional, Apto 10 San José de las lajas, La Habana,
Cuba.
Jersys Arévalo,
Nerdys Acosta,
Alejandra Villoch PhD
Leopoldo Hidalgo PhD.
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