- Resumen
- Principios de clonación
molecular - Métodos de
análisis de ácidos nucleicos - Mapas de
restricción - Reacción en cadena de
la polimerasa - Secuenciación
nucleotídica del ADN - Proyecto del Genoma
Humano - Campos de aplicación de
la tecnología del ADN recombinante - Conclusiones
- Referencias
bibliográficas
Se ofrecen elementos conceptuales sobre algunos de los
métodos de
biología molecular de más amplio uso en
biomedicina. Las principales aplicaciones de estas técnicas
son en el diagnóstico de enfermedades hereditarias,
infecciosas y neoplásicas así como en estudios de
regulación de la expresión génica y en la
terapia con proteínas
recombinantes. El Proyecto del
Genoma Humano tomó como base para su ejecución
muchas de estas técnicas, al tiempo que ha
permitido el desarrollo de
nuevas metodologías y el perfeccionamiento de las ya
existentes. Con la aplicación de las técnicas de
biología molecular en medicina, se
ha abierto también la posibilidad de llevar a cabo la
terapia génica en humanos.
Palabras clave: ácido desoxirribonucleico
(ADN), enzimas de
restricción, reacción en cadena de la polimerasa,
hibridación, secuenciación del ADN, genoma, terapia
génica
La estructura que
conocemos hoy como ADN (ácido desoxirribonucleico) fue
descrita por Watson y Crick en el año 1953. Tras este
hecho confluyeron ideas y nuevos enfoques experimentales que
condujeron a lo que ha sido denominado como dogma central de la
genética
molecular, que establece que la información genética fluye del ADN
al ARN (ácido ribonucleico) y de este a la
proteína, y por tanto es el ADN el material que almacena
la información genética en unidades de
información hereditaria denominadas genes. Aún
cuando este enunciado es cierto para la mayoría de los
seres vivientes; se ha comprobado que en determinados virus la
información genética se almacena en forma de ARN y
esta puede ser transferida del ARN al ADN a través de un
proceso de
transcripción inversa (Moreno, 1996).
Al igual que en las proteínas, el ADN y el ARN
están compuestos por repeticiones de pequeños
bloques, pero con la diferencia de que en lugar de
aminoácidos, se trata de moléculas más
complejas conocidas como nucleótidos. Los
nucleótidos, en el ARN, están dispuestos en una
sola cadena resultante de la copia del ADN en forma
complementaria; en cambio, en el
ADN, los nucleótidos se sitúan formando dos cadenas
orientadas en direcciones opuestas y enrolladas alrededor de un
eje imaginario formando una doble hélice (Moreno,
1996).
El genoma es la información genética con
que cuentan los seres vivos, la cual está almacenada en
los genes y estos a su vez en los cromosomas. Los
cromosomas están compuestos por ADN y un grupo de
proteínas llamadas histonas. El genoma humano contiene
cerca de 3 billones de nucleótidos (pares de bases, pb)
(National Human Genome Research Institute, 2004) presentes en 46
cromosomas (22 autosomas y 2 cromosomas sexuales).
En las últimas décadas la tecnología de
recombinación del ADN también conocida como
ingeniería genética, o más
acertadamente recombinación genética in
vitro, ha revolucionado la Biología. El campo de la
salud es, uno de
los más beneficiados con el desarrollo de esta
tecnología. Las investigaciones
que se realizan en esta área están enfocadas a un
diagnóstico oportuno de enfermedades, así como su
posible tratamiento a través de la terapia con
moléculas recombinantes e introducción de genes. Además, la
manipulación de genes proporciona una herramienta
fundamental para la eliminación futura de enfermedades
mortales para el hombre
(Cerezo & Madrid, 1995).
Por estas razones resulta útil que el médico de
asistencia esté familiarizado con conceptos básicos
sobre biología molecular, su aplicación en la
investigación biomédica, y en
especial con sus posibles aplicaciones clínicas, conceptos
estos que aparecen cada vez con mayor frecuencia en toda la
literatura
biomédica, tanto básica como
clínica.
Principios de
clonación
molecular
La denominación "ADN recombinante" se refiere a
combinaciones muevas de ADN creadas entre secuencias o fragmentos
de esta molécula (los cuales son de interés
por alguna razón) y moléculas de ADN bacteriano (o
de otra clase) capaces
de duplicarse indefinidamente en el laboratorio
(Freifelder, 1983). En este proceso, primero se obtiene un
fragmento del ADN de interés denominado inserto, el cual
se une a otra molécula de ADN (generalmente de mayor
tamaño) llamado vector. Posteriormente se lleva a cabo el
proceso de clonación molecular en sí, en el cual se
introduce el ADN recombinante en una célula
receptora y esta finalmente al multiplicarse da lugar a nuevas
células
con similares características a ella; obteniéndose
de esta manera lo que se denomina un clon. Por consiguiente un
clon no es más que un grupo grande de células,
moléculas de ADN o bacterias que
surge de una célula o molécula ancestral y son
idénticas a esta; y clonación es el proceso que le
da origen (Granner, 1992; Plata 1996).
Las células receptoras del ADN híbrido
pueden ser tanto procariotas como eucariotas y el proceso de
introducción del mismo se denomina transformación
para las primeras y transfección para las segundas
(Cerezo, 1995).
Para llevar a cabo la
clonación molecular se requiere lo
siguiente:
a) Una fuente adecuada de ADN: Las fuentes
más importantes de ADN para clonación son el ADN
genómico (cromosómico) que contiene los genes
completos y lo que se conoce como ADN complementario (ADNc) que
se obtiene a partir del ARN mensajero (ARNm) bajo la acción
de la enzima transcriptasa reversa o transcriptasa inversa
(Freifelder, 1983 & Plata, 1996). Esta enzima es capaz de
sintetizar ADN a partir del ARN el cual le sirve como molde. El
empleo de una
u otra fuente depende de los objetivos que
se persigan con el estudio a realizar.
b) Vectores de
clonación (ADN recombinante): Un vector de
clonación es una molécula pequeña de ADN que
puede replicarse de manera autónoma en un huésped
(células bacterianas o de levaduras), a partir de las
cuales es posible aislarlo en forma pura para el análisis. Los vectores se utilizan para
clonación porque pueden seguir su desarrollo normal a
pesar de que secuencias adicionales de ADN sean incorporadas en
su material genético; se autorreplican utilizando la
maquinaria enzimática de la célula
huésped, y en este proceso, no se mezclan con el ADN
genómico de la célula (Plata, 1996).
Debido a que los vectores de clonación pueden
generar un gran número de copias por célula, ya que
los huéspedes bacterianos o de levaduras pueden crecer
indefinidamente en el laboratorio, es posible obtener grandes
cantidades de secuencias del ADN de interés. Cierto
número de vectores se utiliza de modo común para
este propósito, cada uno con ventajas y limitaciones y
dentro de ellos tenemos:
Plásmidos: Son moléculas circulares
de ADN de doble cadena que se replican de modo
extracromosómico en bacterias, o menos comúnmente
en levaduras (Lehninger, 1993; Ministerio de Educación, 1981). En
ellos se encuentran genes que le confieren al organismo que los
posee resistencia a
algunos antibióticos, así como genes involucrados
en la producción de toxinas y la
degradación de productos
naturales (Stryer, 1995).
Bacteriófagos: Son virus que infectan a
las bacterias y están constituidos, según su clase,
por un núcleo de ADN o ARN y una cubierta proteica;
algunos presentan una cola, y son incapaces de replicarse
autónomamente por lo que necesitan infectar a la
célula para poder hacerlo.
Dentro de los fagos más utilizados como vehículos
moleculares de clonación, se encuentran el lambda
(l ) y sus
derivados (Cerezo, 1995; Freifelder, 1983; Granner, 1992; Moreno,
1996; Plata, 1996; Stryer, 1995).
Cósmidos: Son básicamente
plásmidos que emplean la habilidad de las
partículas infecciosas del bacteriófago
l para "empaquetar" de
manera eficiente grandes piezas lineales de ADN e introducirlas
en las células bacterianas. Estos vectores se reproducen
de igual manera que los plásmidos en las bacterias
(Granner, 1992; Lehninger, 1993).
"Cromosomas artificiales" de levadura:
Además de los vectores anteriormente mencionados, existe
otro tipo que permite clonar hebras de ADN de gran tamaño
y que se conocen como cromosomas artificiales de levadura (YAC,
del inglés
yeast artificial chromosome). Este tipo de vector es capaz de
replicarse en el huésped Saccharomyces cerevisiae
(levadura común usada en panadería) y tiene la
estructura semejante a los cromosomas de levadura normales
(Plata, 1996).
c) Enzimas que permitan la escisión o corte en
sitios específicos del fragmento de ADN a clonar y su
posterior fusión con
el vector: Existe un grupo de enzimas con funciones
diferentes que tienen gran aplicación en ingeniería
genética; de ellas ya se ha mencionado a la
transcriptasa inversa. Nos referiremos con más detalle
ahora a las endonucleasas de restricción o enzimas de
restricción y a la ADN ligasa como útiles herramientas
en el proceso de clonación de genes.
Endonucleasas de restricción: Las
endonucleasas son enzimas que cortan al ADN en secuencias
específicas dentro de la molécula (contrario a las
exonucleasas, que digieren a las moléculas de ADN por sus
extremos) (Granner, 1992). Estas enzimas se encuentran en una
amplia variedad de especies bacterianas y su función
biológica consiste en reconocer y romper el ADN ajeno que
puede penetrar en la célula (por ejemplo, ADN procedente
de bacteriófagos) (Lehninger, 1993). De esta forma estas
endonucleasas restringen el funcionamiento de los fagos en el
interior de la bacteria, motivo por el cual originalmente se les
llamó enzimas de restricción (Granner). El ADN
propio, sin embargo, no es digerido porque las bacterias cuentan
con un mecanismo que impide que esto ocurra. Así, al
conferir la naturaleza
este sistema de
defensa a las bacterias, otorgó también a los
científicos un arsenal de enzimas altamente
específico para manipular el ADN (Granner; Lehninger;
Merino & Gamba, 1996).
ADN ligasa: La ADN ligasa es una enzima que tiene
la capacidad de formar enlaces fosfodiéster en una cadena
de ADN rota, pudiendo unir covalentemente ADNs de diferentes
orígenes para formar moléculas híbridas.
Existen diversos métodos en los que se aprovecha la
acción de esta enzima para la unión del fragmento a
clonar con el vector; la selección
de uno u otro depende de las características de los
extremos de ambas moléculas de ADN (Cerezo & Madrid,
1995).
d) Métodos de transformación o
transfección celular: Una vez obtenido el ADN
recombinante, el próximo paso es introducirlo dentro de
una célula huésped que le ofrezca la maquinaria
necesaria para su autorreplicación. Como no es objetivo de
este trabajo
explicar en detalles cada uno de los métodos que existen
para estos fines, nos limitaremos sólo a mencionar algunos
de los más empleados que son: electroporación,
transfección mediada por calcio-fósforo o
DEAE-dextrán, empleo de polibreno, fusión de
protoplastos, empleo de liposomas, microinyección directa
al núcleo, uso de virus (Cerezo & Madrid, 1995;
Freifelder, 1983; Plata, 1996; Lehninger, 1993; Stryer, 1995),
entre otros.
e) Métodos para analizar los clones
resultantes hasta la identificación del que contiene el
gen de interés: Un importante paso en el proceso de
clonación es la identificación de aquel clon o
clones que contienen el ADN recombinante. Aún en las
mejores condiciones los plásmidos se mantienen de forma
estable sólo en una minoría de la población bacteriana. Para identificar
estos transformantes se emplean varios métodos, los cuales
también solamente serán mencionados. Así
tenemos los ensayos de
hibridación (Freifelder, 1983; Lehninger, 1993; Mercado &
Gamba, 1997; Plata, 1996), los métodos
inmunológicos (anticuerpos radiactivos,
inmunoprecipitación) (Freifelder; Plata), el empleo de
marcadores de selección (Freifelder ), etc.
Métodos de
análisis de ácidos
nucleicos.
Hibridación molecular.
La hibridación molecular es uno de los pilares de
la mayor parte de las metodologías que se utilizan en el
laboratorio de biología molecular. Un grupo de estas
técnicas se ha diseñado para identificar
determinadas secuencias en los ácidos
nucleicos.
La hibridación se refiere al apareamiento
específico que ocurre entre cadenas de ácidos
nucleicos con secuencias complementarias, proceso que es
análogo a la reacción antígeno-anticuerpo, pero con la diferencia
de que en la hibridación en lugar de anticuerpos se
emplean las llamadas sondas (Mercado & Gamba, 1997). Las
sondas no son más que fragmentos cortos de ADN o ARN
sintetizados in vitro y que se marcan con sustancias
radiactivas fluorescentes o de otro tipo a fin de hacer posible
su posterior detección y de esta manera la
identificación de la secuencia de ADN o ARN de
interés (Cerezo & Madrid, 1995; Mercado &
Gamba).
A continuación se señalan diferentes
procedimientos
de laboratorio que utilizan el principio de hibridación y
en los que la variación está dada por el tipo de
ácido nucleico utilizado, el soporte en que se lleva a
cabo la hibridación y la forma de colocar los
ácidos en la membrana.
Southern blot: Es una técnica empleada
para detectar secuencias específicas de ADN. Para llevar a
cabo hibridaciones de este tipo, se aísla el ADN de un
tejido o línea celular, luego se purifica, y se digiere
con enzimas de restricción específicas. Los
fragmentos generados se separan mediante electroforesis y
después son transferidos a la membrana que sirve de
soporte (gel de agarosa). Este proceso se lleva a cabo colocando
el gel de agarosa sobre papel filtro previamente remojado en una
solución llamada de transferencia (solución salina
concentrada). A continuación se sitúa la membrana
sobre el gel y encima de esta una pila de papel filtro seca, y
por capilaridad la solución de transferencia es
atraída a la pila de papel filtro, arrastrando consigo al
ADN hacia la membrana, donde queda inmovilizado conservando la
misma posición relativa que ocupaba en el gel. Luego, el
ADN puede ser hibridado en la membrana con una sonda marcada
(Cerezo & Madrid, 1995; Correa-Rotter & Gamba,
1997).
Debido a que la transferencia del ADN del gel a la
membrana se produce por capilaridad, con el mismo principio
utilizado por años para limpiar manchas con papel secante,
el proceso se conoce en inglés como blotting; Southern
propuso utilizar el término blot (secado) o blotting para
referirse a esta técnica y actualmente se conoce como
Southern blot (Mercado & Gamba, 1997).
Esta técnica se ha empleado para el
diagnóstico y caracterización de diversas
inmunodeficiencias, la distrofia muscular de Duchenne, la
hipoplasia adrenal congénita, la deficiencia de
glicerol-quinasa, la distrofia miotónica severa y en
análisis de mutaciones de genes en células B de
leucemia linfoblástica crónica, entre otras
enfermedades (Cerezo & Madrid, 1995).
Northern blot: Es una variante del método
anterior en el que en lugar de utilizar ADN como sustrato de
estudio, se emplea ARN. El procedimiento que
se sigue es similar al Southern blot y por analogía con
este se le conoce como Northern blot. Esta técnica se ha
aplicado en estudios de la modulación
de la síntesis
de interleucina 6 en pacientes con artritis reumatoide, en el
análisis de expresión de receptores que participan
en la síntesis de moléculas en cultivos celulares,
en análisis de mutaciones y alteraciones del RNAm de
enzimas, y en la regulación de la expresión
génica de marcadores
moleculares de células leucémicas humanas y
moléculas del reconocimiento inmunológico (Cerezo
& Madrid, 1995).
Western blot: No es un método de
análisis directo de los ácidos nucleicos, sino del
producto de la
expresión de los genes, o sea las proteínas. Aunque
difiere de los anteriores en cuanto a que no existe
hibridación, sino que la identificación de las
proteínas se realiza con anticuerpos marcados, sí
se mantiene el principio de la transferencia a la membrana que
sirve de soporte posterior a la electroforesis y previo a la
identificación, y por lo cual siguiendo el juego de
palabras ha sido denominado de esta manera (Cerezo & Madrid,
1995; Mercado & Gamba, 1997). Esta técnica permite el
desarrollo de pruebas para
diferenciar tipos de virus
que infectan a células, se ha aplicado en estudios de la
variabilidad individual de los niveles de determinadas enzimas,
en la caracterización molecular de genes (Cerezo &
Madrid), etc.
Dot blot y slot blot: Son procederes similares al
Northern con la diferencia de que el ARN no es sometido a
electroforesis sino que se sitúa directamente sobre la
membrana. Este tipo de análisis requiere de un molde
asociado a succión con vacío para colocar el ARN
que puede producir círculos o puntos (dot blot) o
hendiduras (slot blot). Este tipo de prueba es muy útil
cuando se quieren estudiar gran número de muestras, pero
tienen la limitante de no ofrecer información sobre el
tamaño de las bandas del ARN hibridado (Correa-Rotter
& Gamba, 1997).
Hibridación de colonias bacterianas: Es un
método empleado para identificar colonias bacterianas que
contengan determinada secuencia de ácidos nucleicos de
interés. La metodología consiste en sembrar los clones
sobre placas de Petri con agar para después de crecidos
transferirlos a membranas de nylon o nitrocelulosa y luego
realizar la hibridación (Plata, 1996).
Hibridación in situ: Es un
método histoquímico que emplea a la biología
molecular de la misma manera que la inmunohistoquímica
utiliza los métodos de la inmunología. La especificidad de la
hibridación in situ (HIS) se basa en la
unión recíproca de una secuencia de
oligonucleótidos (la sonda), con una secuencia
complementaria de nucleótidos presente en las
moléculas de ARN o ADN dentro del tejido
(Quintanilla-Martínez & Gamba, 1997).
Entre las ventajas de esta técnica están
su alto grado de resolución espacial que permite la
localización de secuencias génicas a escala
cromosómica, con lo que se pueden detectar translocaciones
y otras alteraciones, así como también el estudio
de expresión génica a escala celular y subcelular.
Otra de sus ventajas es que se puede realizar en material fijado
e incluido en parafina lo que permite realizar estudios
retrospectivos en material de archivo. Por otra
parte la cantidad de tejido requerido para realizar un estudio de
HIS es mínima en comparación con otras
técnicas de biología molecular
(Quintanilla-Martínez & Gamba, 1997).
Entre las principales aplicaciones de la HIS tenemos la
detección de ARN o ADN de origen viral, el análisis
de la expresión génica (detección de ARNm) y
los análisis cromosómicos
(Quintanilla-Martínez & Gamba, 1997).
La HIS con fluorescencia (FISH) (Hogge &
Mowery-Rushton, 1997; Bobadilla & Gamba, 1996) es una
importante herramienta de uso rutinario en investigación y
con grandes posibilidades de aplicación en el
diagnóstico de enfermedades neoplásicas,
genéticas, estudios a nivel cromosómico, etc. En
ella la sonda se marca con
sustancias fluorescentes que se visualizan después
mediante microscopía.
Esta técnica se basa en el principio de la
enzimología de restricción donde de una
molécula de ADN dada se obtendrán siempre los
mismos fragmentos cada vez que sea expuesta a una enzima de
restricción particular. La complejidad del mapa depende
del tamaño de la molécula (a mayor número de
bases será mayor el número de sitios de
restricción) y del número de enzimas utilizadas. De
esta forma, dos moléculas de ADN del mismo tamaño
pueden ser fácilmente diferenciadas por los mapas de
restricción que producen al tratarlas con las mismas
enzimas (Merino & Gamba, 1996).
Este mismo principio lo utiliza el procedimiento
denominado análisis de polimorfismos de longitud de
fragmentos de restricción (RFLP) (Granner, 1992), pero
aprovechando el hecho de la existencia de variaciones en la
constitución genética de la
población (polimorfismo genético), que hace que se
observen diferencias entre los individuos en cuanto al
número y longitud de los fragmentos producidos. La
existencia de los RFLPs es la base de la técnica que se ha
denominado huellas digitales del ADN y que permite
establecer inequívocamente la relación padres e
hijos, entre otras aplicaciones.
Reacción
en cadena de la polimerasa.
La reacción en cadena de la polimerasa o PCR como
comúnmente se conoce (del inglés polymerase chain
reaction) es un método enzimático de
amplificación de secuencias específicas de ADN,
concebido por Kary Mullis y sus colaboradores a principios de los
años 80. Este método permite la síntesis
in vitro de un fragmento de ADN de forma tal que, en cada
ciclo del proceso, se duplica el número de
moléculas (Bobadilla & Gamba, 1996).
El principio del PCR consiste en determinar la secuencia
de interés y seleccionar pequeños segmentos de
nucleótidos llamados iniciadores o cebadores,
complementarios con la secuencia de nucleótidos de los
extremos opuestos de las cadenas que flanquean a dicha secuencia,
a partir de los cuales se inicia la elongación o
síntesis de nuevas cadenas en el extremo 3' de cada
iniciador (Cerezo & Madrid, 1995).
En esta técnica se consideran importantes los
siguientes parámetros: un suministro abundante de
iniciadores y de desoxinucleótidos trifosfatados (dNTPs);
una fuente renovada de ADN polimerasa (enzima encargada de la
síntesis de las cadenas complementarias); y los ciclos
periódicos de cambios de temperatura.
Estos últimos consisten en: desnaturalización del
ADN a 100°
C, alineamiento de los iniciadores con las secuencias de
interés entre 50 y 60° C y síntesis del ADN a
72° C. Estas
temperaturas pueden variar de acuerdo con las condiciones de la
reacción (Bobadilla & Gamba, 1996).
Cuando se comenzó a utilizar la PCR, el empleo de
la ADN polimerasa I de E. coli hacía el proceso muy
tedioso, pues esta enzima perdía su función al
incrementar la temperatura, lo que obligaba a agregar ADN
polimerasa en cada ciclo. Con la introducción de la
llamada Taq polimerasa, una ADN polimerasa aislada de la bacteria
Thermus aquaticus que vive en aguas termales y tiene una
temperatura óptima entre 70 y 75° C, la PCR se hizo más
eficiente, más accesible e incluso fue posible
automatizarla (Cerezo & Madrid, 1995).
El poder de la amplificación con PCR es tan alto
que los más pequeños contaminantes pueden dar
resultados falsos positivos, por lo que el material y las
soluciones a
emplear deben ser escrupulosamente controlados.
Las aplicaciones de la PCR son múltiples y
parecen estar sólo limitadas por la imaginación de
los científicos. Entre ellas tenemos: la
amplificación de fragmentos de genes como rápida
alternativa de la clonación, la modificación de
fragmentos de ADN, la detección sensible de
microorganismos seguido de una segura genotipificación, si
se desea, el análisis de muestras arqueológicas y
estudios antropológicos, la detección de mutaciones
importantes en enfermedades hereditarias, transformación
maligna o tipaje de tejidos, el
análisis de marcadores genéticos para aplicaciones
forenses, pruebas de paternidad y para el mapeo de rasgos
hereditarios, el estudio de expresión de genes, entre
otras (Herrera & Gamba, 1996).
Secuenciación nucleotídica del
ADN.
La consecuencia inmediata de clonar un fragmento de ADN
es la posibilidad de secuenciarlo. El entendimiento a fondo de la
estructura, función y mutación de un fragmento de
ADN depende en primera instancia de conocer la estructura
primaria de sus nucleótidos; es decir, la secuencia de
nucleótidos.
Básicamente existen dos métodos para la
secuenciación del ADN, uno químico y otro
enzimático, desarrollados en la década de los 70
por Maxam y Gilbert y Sanger y colaboradores (Lehninger, 1993;
Ministerio de Educación, 1981),
respectivamente.
Conocer la secuencia de un segmento de ADN que ha sido
clonado, representa una gran ventaja para su
caracterización ya que, a través de la secuencia es
posible determinar las diferentes regiones que conforman un gen,
deducir la secuencia de aminoácidos para la
síntesis de una proteína y la formación de
sus estructuras
secundarias (Cerezo & Madrid, 1995). En medicina la
secuenciación del ADN tiene importantes implicaciones en
la comprensión de los mecanismos fisiopatológicos
que se generan por la inferencia en la secuencia y
homología entre genes. El
conocimiento de genes responsables de enfermedades
hereditarias hace posible mediante secuenciación,
identificar a individuos portadores asintomáticos o en
fase preclínica (Martínez & Gamba, 1996). La
secuenciación del genoma de determinados agentes
biológicos patógenos por ejemplo Haemophilus
influenzae (Caskey, 1997) y Helicobacter pilory
(Scientists complete decoding of the H pylori genome, 1997)
permite, además de comprender los mecanismos de
producción de la enfermedad, desarrollar nuevos
métodos diagnósticos y
terapéuticos.
El Proyecto del Genoma Humano (PGH), esfuerzo
internacional considerado por muchos como una de las empresa
más grandes emprendidas por el hombre en
todos los tiempos, dirigido a entender, fundamentalmente, nuestro
genoma, comenzó en Estados Unidos en
1990 cuando al Instituto Nacional de Salud y al Departamento de
Energía se unieron otras instituciones
del resto del mundo para descifrar la masiva cantidad de
información contenida en él. Su ejecución
tomó como base el arsenal de conocimientos y herramientas
aportados por la biología molecular y la computación hasta ese momento. Este
proyecto en sus inicios se trazó un grupo importante de
ambiciosas metas las cuales han sido sobrepasadas en su
mayoría. Su conclusión estaba prevista para el
año 2005, sin embargo, ya el 14 de abril de 2003, algo
más de dos años antes y coincidiendo con el 50
aniversario de la descripción por James Watson y Francis
Crick de la doble hélice del ADN; el Consorcio
Internacional para la Secuenciación del Genoma Humano
anunciaba su culminación exitosa, la cual alcanzó
una exactitud del 99,99 %, lo que equivaldría a
sólo un error por cada 10000 pb (National Human Genome,
2004, National Human Genome Research Institute, National
Institute of Health, 2004).
La secuenciación del genoma humano es sólo
el comienzo de lo que ha sido denominado era genómica y el
conocimiento
que de ello se derive permitirá arrojar luz sobre un
amplio espectro de cuestiones básicas tales como,
cuántos genes tenemos, cómo trabajan las
células, como evolucionaron los seres vivientes,
cómo una simple célula se desarrolla en complejas
criaturas, qué sucede exactamente cuando enfermamos.
Además de responder innumerables preguntas sobre nuestra
individualidad molecular. Las aplicaciones directas en medicina
incluyen el diagnóstico, pronóstico y
prevención de diversas enfermedades, así como su
tratamiento efectivo. En 1990, por ejemplo, se tenia idea de la
existencia de alrededor de 100 genes involucrados en determinadas
enfermedades; hoy se han identificado más de 1400 y la
lista continúa incrementándose. Muchas de estas
enfermedades serán blanco de disciplinas que se han
desarrollando en los últimos años, como la
farmacogenómica y la terapia basada en los genes (An
Interview with Francis S. Collins, M.D., Ph.D., 2003;
Austin, 2003; Collins, Green, Guttmacher & Guyer,
2003).
Campos de
aplicación de la tecnología del ADN
recombinante
Uno de los principales objetivos de la ingeniería
genética ha sido la producción de grandes
cantidades de proteínas, las cuales por demás
pueden ser difíciles de obtener de sus fuentes naturales
(bien porque son producidas en baja concentración por la
célula o porque su manipulación es demasiado
peligrosa) (Freifelder, 1983). La importancia de obtener tales
proteínas por esta vía estriba, entre otros
aspectos, en su bajo costo de
producción y en que algunas de ellas como la insulina,
el interferón y la hormona del crecimiento
(somatotropina), concebidas para terapia en humanos por otros
medios, pueden
inducir reacciones alérgicas (Ministerio de
Educación, 1981)
La fuente principal de proteínas vía
recombinación genética in vitro son los
microorganismos, aunque los animales y
plantas
también son empleados en ensayos para obtener
proteínas de interés; así por ejemplo
investigadores de la misma compañía que
clonó la oveja Dolly en Escocia a mediados de los
años 90, lograron la obtención de una oveja
transgénica que produce en su leche la
proteína de la coagulación humana factor IX
(Scientists achieve new breakthroughs in cloning of transgenic
animals, 1998). La hemoglobina humana recombinante ha sido
sintetizada en cultivos de bacterias, levaduras y en
células animales transfectados, sin embargo, las plantas
transgénicas parecen ofrecer, a juicio de los
investigadores, un número de ventajas que incluyen la
reducción de los problemas del
envejecimiento de la sangre de
banco,
así como la exclusión de contaminantes derivados de
fuentes bacterianas o animales (Researchers use tobacco plants to
synthesize human haemoglobin, 1997). Se trabaja, por otra parte,
en la producción de animales transgénicos y
clonados que expresarían inmunoglobulinas y otros
productos biofarmacéuticos para el tratamiento de
enfermedades autoinmunes (Pigs cloned to produce human
antibodies, 1997).
Son también ejemplos del poder de la
ingeniería genética en el terreno de la medicina la
identificación de genes sin conocer la función de
sus productos en procesos
patológicos como la ataxia telangiectasia, la
poliquistosis renal y el subtipo infantil de lipofuscinosis
ceroide (McCabe, 1996). En otras enfermedades se ha podido
profundizar en su fisiopatología, tal es el caso de la
fibrosis quística (Ramsey, 1996) y la enfermedad de
Alzheimer
(Mcmanus & Gascoyne, 1997; Transgenic mice provide insights
into Alzheimer’s desease, 1998). La recombinación
genética in vitro ha permitido, además,
encontrar los genes responsables de enfermedades como la
distrofia miotónica, la enfermedad de Huntington, la
hemocromatosis hereditaria (Voelkerding, 1998) y algunos tipos de
inmunodeficiencias (Villa, 1997; Spickett, 1997).
Uno de los grandes retos que tiene la medicina actual es
llegar a conocer con certeza los mecanismos y procesos
involucrados en la génesis del cáncer y poder
actuar en consecuencia. La clonación de genes ha revelado
la existencia de dos categorías génicas que se
caracterizan por la presencia de mutaciones específicas y
que tienen un importante papel en la expresión de
células cancerosas, estas categorías corresponden a
los oncogenes y a los genes supresores del cáncer. Se ha
agregado a estas una nueva categoría cuyas mutaciones se
vinculan específicamente con el cáncer
colorectal, se trata de los genes de la reparación de
errores de apareamiento del ADN (National Cancer
Institute–National Human Genome Research Institute
Workshop, 2004).
Un enfoque no menos importante en la utilización
de la tecnología del ADN recombinante en medicina es la
terapia génica. Como concepto la
terapia génica consiste en la transferencia de material
genético a las células de un enfermo,
produciéndole efectos terapéuticos
benéficos. En principio se podrían tratar
enfermedades hereditarias como la inmunodeficiencia severa
combinada, la anemia
falciforme, la distrofia muscular, la fibrosis quística,
etc. (Moreno & Gamba, 1996), aunque de modo general cualquier
afección en la que se pudiese demostrar una
alteración génica como factor involucrado en su
fisiopatología; sería susceptible de recibir esta
terapéutica.
Aun cuando hasta el momento no se dispone de un vector
que permita una transferencia de genes directamente dentro del
paciente, que sea eficiente, efectiva y estable, la terapia de
genes es fuente de esperanzas para investigadores,
médicos, pacientes y familiares (Marshal, 1995; Vogel,
1997). Los vectores virales aunque han sido los más
empleados no satisfacen las expectativas iniciales. Ahora se
prueba con otros vectores no virales como los liposomas (Ramsey,
1996) y se piensa incluso en usar las células
indiferenciadas y con alta capacidad para multiplicarse de la
médula ósea, para modificarlas genéticamente
en el exterior y luego tratar con ellas no sólo trastornos
hematológicos, sino también, afecciones del
colágeno, hueso y músculo; dada su capacidad de
distribuirse por todo el organismo después de madurar
(Brenner, 1996).
Hoy prácticamente no existen dudas de que la
Biología Molecular con sus métodos, unido a los
conocimientos derivados del Proyecto del Genoma Humano
afectará el curso de la ciencia y
la medicina a lo largo del siglo 21. La fisiopatología de
más y más enfermedades será comprendida
hasta el nivel molecular, se desarrollarán nuevas drogas
dirigidas contra las causas subyacentes de las enfermedades, las
pruebas genéticas antes de prescribir una droga
asegurarán que cada individuo
reciba aquellos medicamentos que traten sus malestares
efectivamente sin efectos colaterales, aumentará nuestro
conocimiento sobre cuestiones básicas de Biología,
los científicos entenderán mejor los componentes
esenciales de la vida y cómo funcionan las células
y organismos; sin embargo, el reto fundamental estará en
mantener un balance saludable que evite los daños
potenciales derivados de estos avances, y permita preservarlos
sólo para darle un uso adecuado.
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Springer.
Autor:
Dr. Vladimir Ruiz Álvarez,
Especialista de Primer Grado en Laboratorio
Clínico. Master en Bioquímica General.
Profesor
Asistente de Bioquímica y Laboratorio
Clínico,
Dirección: Instituto de Nutrición e
Higiene de
los Alimentos,
Laboratorio de Bioquímica y Fisiología, Calzada de Infanta 1158,
Entre Clavel y Llinás, CP. 10300,
Ciudad de La Habana, Cuba.
Teléfono: (537) 879 5183
;
Dr. Rafael Menéndez Lorenzo,
Especialista de Primer Grado en Medicina Interna,
Profesor
Asistente de Medicina Interna,
Instituto superior de Ciencias
Médicas de La Habana, Facultad de Ciencias
Médicas Calixto García