Para biólogos, médicos,
agrónomos y veterinarios
- Práctica de laboratorio #
1. Células procariotas y
eucariotas - Práctica de laboratorio #
2. Cloroplastos y pigmentos
fotosintéticos - Práctica de laboratorio #
3. Estudio de la actividad de las
peroxidasas - Práctica de laboratorio #
4. Estudio cinético del enzima
alfa-amilasa - Práctica de laboratorio #
5. Acción hidrolítica de las amilasas de
semillas de gramíneas - Práctica de laboratorio #
6. Acción hidrolítica de las lipasas de
semillas de oleaginosas - Práctica de
laboratorio # 7. Reacciones de
transaminación - Práctica de laboratorio #
8. Respiración en células
vegetales
Estimado Estudiante o Profesor
:
Cuando un estudiante graduado de un nivel medio de
enseñanza decide optar por el estudio en el
nivel superior de carreras de las Ciencias
Biológicas puras o aplicadas como las Ciencias
Médicas, la Cultura
Física, la
Veterinaria o
la Agronomía se encuentra con el hecho de que en casi
todas ellas se encuentran incluidos cursos iniciales de Química que pueden
abordar contenidos básicos de la Química General ,
Química Orgánica y Bioquímica. Los laboratorios que
generalmente aparecen en los manuales son
dedicados a los estudiantes de Ciencias Químicas por lo
que presentan poca vinculación con estas otras
carreras.
El presente manual se
elaboró dirigido a el resto de las carreras que reciben la
Bioquímica como una asignatura básicaEste manual
tiene como característica que los laboratorios
están diseñados en forma de experimentos. El
nivel de complejidad va en incremento de forma tal que los
experimentos precedentes van preparando al estudiante para el
desarrollo de
los posteriores y las habilidades prácticas se van
sistematizando a lo largo de los diferentes laboratorios. Al
final d cada uno de ellos se orienta la realización d un
informe que
facilita la integración de los
conocimientos.
Otra característica importante es que la
mayoría de los laboratorios emplean materiales
obtenidos de fuentes
naturales para comprobar en ellos la presencia y
transformación de las sustancias que se quieren estudiar.
Esto permite que el estudiante tenga mayor vinculación con
la vida y con la carrera específica que estudia , lo que
hace más amenos estos laboratorios.
Esperamos que los mismos sean de utilidad para sus
estudios. Muchas gracias.
Los autores
PRACTICA DE LABORATORIO #
1.
CELULAS PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS.
INTRODUCCION.
Por su pequeño tamaño las bacterias no
resultan fáciles de distinguir al microscopio
óptico sin la ayuda de coloraciones específicas.
Algunos métodos
complejos de coloración dan incluso la posibilidad de
diferenciar unas bacterias de otras, y estudiar particularidades
de la estructura de
las células
bacterianas. Un ejemplo de éstos es el desarrollado por
Gram en 1884, pero que no ha perdido su valor
práctico hoy día. En el caso de este método las
bacterias se subdividen en grampositivas y gramnegativas, lo que
facilita la realización del diagnóstico diferencial de algunas enfermedades infecciosas,
así por ejemplo se sabe que todos los cocos
patógenos, excepto los gono y meningococos, son
grampositivos; los vibriones, treponemas y representantes de
la familia de
las bacterias intestinales son gramnegativos, y todos los bacilos
y clostridios son grampositivos.
En el caso de la coloración por este
método los microorganismos son sometidos a dos procesos de
tinción consecutivos y separados entre sí por una
decoloración alcohólica. La primera tinción
se realiza con el colorante de violeta genciana o violeta de
metilo, y la segunda con fucsina. En este caso los
microorganismos grampositivos se tiñen de color violeta y
los gramnegativos de color rosado-rojo, lo que está
condicionado por las particularidades de la estructura y la
composición química de las células de los
microorganismos: en los grampositivos la pared celular consta, en
lo fundamental de una capa gruesa de mureína (90%) y
ácido teicoico, mientras que en los gramnegativos la pared
contiene solamente un 5-10% de mureína, no hay
ácido teicoico y tienen una mayor cantidad de proteínas
y lípidos en
su pared. En el transcurso de la coloración, durante el
tratamiento con alcohol las
bacterias grampositivas cierran los poros de su pared impidiendo
la salida del colorante y conservando el color violáceo
que las caracteriza, mientras que las gramnegativas, de paredes
más finas lo pierden al ser tratadas con alcohol, se
decoloran y luego pueden reteñirse con el segundo
colorante rosado.
BIBLIOGRAFIA.
– Chechetkin, A.V. Prácticas del ganado y las
aves de
corral. Editorial Mir, 1984.
– Pequeño Pérez, J. Prácticas de
Fisiología Vegetal. Editorial Pueblo y
Educación,
1972.
PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO # 1:
OBSERVACION DE CELULAS PROCARIOTAS. TINCION DE GRAM
PARA BACTERIAS.
MATERIALES Y REACTIVOS:
- Suspensión de cultivo bacteriano o material
biológico fuente de bacterias a examinar. - Solución de violeta genciana o de violeta de
metilo - Solución de Lugol
- Alcohol al 95 %
- Solución Fucsina o Safranina para
contrateñir - Goteros, pipetas, portaobjetos, mechero, microscopio
con lente de inmersión.
PROCEDIMIENTO:
- Tome con la ayuda del gotero una muestra de la
suspensión bacteriana a examinar y colóquela
cuidadosamente sobre el portaobjetos. Fije las células
por calor al
mismo con la técnica del frotis. - Sobre el frotis fijado vierta la solución de
violeta y deje en reposo 1 minuto. Luego vierta la
solución. - Trate el frotis con la solución de Lugol
durante 3 minutos y sin lavarlo con agua, se
vierte luego la solución. (El Lugol forma un complejo
cristal violeta-iodo). - Decolore el frotis con alcohol al 95 % durante 0,5
min (30 seg) moviendo el portaobjetos hasta que desaparezcan
los chorros gris violáceos del colorante. Después
lave con agua. - Sobre el frotis eche la Fucsina o la solución
de Safranina para realizar la contratinción. Al cabo de
1 ó 2 minutos se vierte el colorante, el preparado se
lava con agua, se seca con papel de filtro. - Observe al microscopio la tinción utilizando
el lente de inmersión. Localice las bacterias y
determine al tipo que pertenecen.
EXPERIMENTO # 2:
OBSERVACION DE CELULAS EUCARIOTAS ANIMALES Y
VEGETALES.
MATERIALES Y REACTIVOS.
- Suspensión de células de mieloma o
hibridomas murinos. - Tejido vegetal como fuente de células para su
observación. - Solución acuosa de Azul tripán al
1% - Portaobjetos, cuchillas, pipetas,
microscopio.
PROCEDIMIENTO:
- Con la ayuda de una cuchilla realice un corte al
tejido vegetal de forma longitudinal y extraiga una muestra lo
más fina posible. Colóquela en un portaobjetos y
observe al microscopio utilizando diferentes aumentos de forma
progresiva. Esquematice lo observado en un campo del
microscopio. - Utilizando una pipeta extraiga una gota de la
suspensión celular de mielomas o hibridomas y
deposítela en un portaobjeto. Observe al microscopio
utilizando distintos aumentos crecientes e identifique las
formas y tamaños de las células, en
comparación con las vegetales observadas
anteriormente. Esquematice lo observado en un campo del
microscopio.REPORTE DE
LABORATORIO.Experimento # 1: Observación de
células procariotas. Tinción de
Gram.1.¿ Por qué es necesario observar las
bacterias utilizando métodos de coloración y el
lente de inmersión en microscopía óptica?2. Anexe el dibujo del
campo observado por usted al realizar la coloración de
Gram a la suspensión bacteriana. ¿De qué
color aparecen teñidas las bacterias?3. Identifique el tipo de bacteria observado en el
cultivo (según su reacción a la tinción
de Gram) y explique por qué se observa de ese
colorExperimento # 2: Observación de
células eucariotas animales y vegetales.1. Anexe los dibujos de
los campos observados en cada uno de los pasos de la
técnica de trabajo.2. Compare los rasgos característicos de las
células vegetales y las células animales
observadas. - Repita el procedimiento
del paso anterior pero adicionando previamente a la gota de la
suspensión celular otra gota del colorante Azul
tripán. Observe al microscopio y determine
cualitativamente la viabilidad del cultivo celular. - Valore cualitativamente la calidad del
cultivo de células animales examinados basándose
en la tinción de Azul tripán.
CLOROPLASTOS Y PIGMENTOS
FOTOSINTETICOS.
INTRODUCCION.
Uno de los procesos metabólicos más
importantes de las células vegetales lo constituye la
Fotosíntesis. Durante la fase luminosa de
la misma es imprescindible la participación de diferentes
pigmentos fotosintéticos que se encuentran dentro de los
plastidios, y que le confieren la coloración
característica de las hojas de las plantas. Los
pigmentos de mayor importancia son las clorofilas: la clorofila A
que tiene un color verde azulado, y la clorofila B de color verde
amarillento. También son importantes los carotenoides, de
color anaranjado-rojizo, y las xantofilas de color
amarillo.
El surgimiento de los métodos
cromatográficos está marcado precisamente por el
estudio realizado por el científico ruso M.S.Tswett, quien
en 1903 publicó un trabajo sobre la separación de
pigmentos vegetales a través de una columna llena de un
compuesto adsorbente (yeso, alúmina,
almidón u otro) al aplicar un extracto de plantas
preparado con solventes orgánicos (etanol, acetona,
benceno, etc.). La separación de estos pigmentos se puede
realizar también mediante cromatografía en capa fina o en papel,
utilizando diferentes sistemas de
solventes.
Bibliografía.
– Chechetkin, A.V. Prácticas del ganado y las
aves de corral. Editorial Mir, 1984.
– Pequeño Pérez, J. Prácticas de
Fisiología Vegetal. Editorial Pueblo y Educación,
1972.
– Gott, A Cromatografía en capa fina. ISPH,
1982.
PARTE EXPERIMENTAL
MATERIALES Y REACTIVOS.
- Microscopio óptico Hojas de Elodea
- Portaobjetos Hojas de plantas de
diferentes - Cubreobjetos Colores
- Mortero Acetona al 85% en agua
- Tubos de ensayo
Etanol al 90% - Papel cromatográfico
- Papel de filtro Espectrofotómetro
PARTE EXPERIMENTAL.
PROCEDIMIENTO:
Observación de cloroplastos en hojas de
Elodea.
- Coloque en un portaobjetos hojas de Elodea, y
cúbralas con el cubreobjetos. - Coloque la preparación en la platina del
microscopio óptico, y enfoque comenzando con el menor
aumento, para observar los cloroplastos. - Dibuje un esquema de lo observado en el
microscopio.
Extracción de pigmentos vegetales y
separación cromatográfica.
1. Pese 2 gramos de hojas frescas (de un mismo color)
desmenuzadas y tritúrelas en el mortero, añadiendo
una pequeña cantidad de arena.
2. Añada poco a poco 5 ml del solvente
orgánico seleccionado para la extracción (acetona
al 85%, etanol al 90%, ó tolueno: acetona 4:1) para
realizar la extracción de los pigmentos.
3. Filtre el extracto y recoja el filtrado que contiene
los pigmentos. Anote su color.
4. Aplique sobre una tira de papel cromatográfico
una alícuota del extracto obtenido a unos 2 ó 3 cm
del borde inferior del papel, cuidando que la mancha de la
solución no exceda del tamaño de 0,5 cm (proceda
punteando poco a poco, dejando secar entre punteos).
5. Coloque la tira en la cámara
cromatográfica, cuidando que el nivel de líquido no
llegue al punto de aplicación de la solución de
pigmentos. Deje ascender el solvente aproximadamente 10
cm.
6. Observe el desarrollo del cromatograma. Analice las
zonas en que se han separado la mezcla de pigmentos vegetales
contenidas en las hojas.
Extracción de pigmentos vegetales y
separación cromatográfica.
- Pese 2 gramos de hojas frescas (de un mismo color)
desmenuzadas y tritúrelas en el mortero,
añadiendo una pequeña cantidad de
arena. - Añada poco a poco 5 ml del solvente
orgánico seleccionado para la extracción (acetona
al 85%, etanol al 90%, ó tolueno: acetona 4:1) para
realizar la extracción de los pigmentos. - Filtre el extracto y recoja el filtrado que contiene
los pigmentos. Anote su color. - Aplique sobre una tira de papel cromatográfico
una alícuota del extracto obtenido a unos 2 ó 3
cm del borde inferior del papel, cuidando que la mancha de la
solución no exceda del tamaño de 0,5 cm (proceda
punteando poco a poco, dejando secar entre
punteos). - Coloque la tira en la cámara
cromatográfica, cuidando que el nivel de líquido
no llegue al punto de aplicación de la solución
de pigmentos. Deje ascender el solvente aproximadamente 10
cm. - Observe el desarrollo del cromatograma. Analice las
zonas en que se han separado la mezcla de pigmentos vegetales
contenidas en las hojas.
Espectro de absorción de los
pigmentos.
- Extraiga con el solvente seleccionado los pigmentos
separados. Para ello recorte la zona de la tira de papel
cromatográfico deseada y colóquela en un tubo de
ensayos que
contiene 2 ml del solvente. - Coloque en el espectrofotómetro visible un
tubo blanco con una muestra del solvente utilizado, y
seleccione la longitud de onda de 400 nm. Ajuste la lectura a
0 de absorbancia con el blanco. - Coloque en el espectrofotómetro el tubo con la
solución del pigmento y lea su absorbancia. Si el
extracto está muy concentrado, dilúyalo con el
mismo solvente hasta que el valor de absorbancia se encuentre
entre 0,05 y 0,1. - Realice el espectro de absorción del pigmento
dado, leyendo los valores
de absorbancia registrados en el equipo al ir variando la
longitud de onda utilizada en 10 unidades cada vez, hasta
llegar a 700 nm. Tenga cuidado de ajustar con el blanco antes
de cada lectura. - Realice un gráfico de absorbancia (en el eje
ordenado) contra longitud de onda utilizada (en el eje de
abscisas) para cada uno de los pigmentos. Compare los
máximos de absorción obtenidos para cada
uno.
REPORTE DE
LABORATORIO.
1. Represente esquemáticamente lo observado al
microscopio. ¿Qué conclusiones puede dar sobre el
número y la ubicación de los pigmentos dentro de
las células de Elodea examinadas?
2. Dibuje un esquema del cromatograma y analice el
cromatograma obtenido. Identifique, atendiendo a su
coloración, los diferentes pigmentos separados por este
método. ¿Por qué la extracción no se
realiza con agua? (Anexe el cromatograma obtenido por su
equipo)
3. Realice los gráficos de Absorbancia contra longitud de
onda para cada uno de los pigmentos analizados. Señale los
máximos de absorbancia para cada pigmento y
relaciónelos con el color característico de los
mismos.
¿Qué papel juega la presencia de
diferentes pigmentos captadores de energía luminosa,
además de las clorofilas, en los fotosistemas del
cloroplasto?
PRACTICA DE LABORATORIO #
3.
ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD DE LAS
PEROXIDASAS.
INTRODUCCIÓN.
Un numeroso grupo de
enzimas
oxidorreductasas pueden transferir directamente el hidrógeno separado de diferentes sustratos
al oxígeno
molecular, obteniéndose como resultado peróxido de
hidrógeno. Este compuesto constituye un tóxico
poderoso para las células, razón por la cuál
tienen necesidad de eliminarlo, disponiendo para ello de otras
oxidorreductasas entre las cuales se encuentran las
peroxidasas.
Estas enzimas catalizan la oxidación de fenoles y
otra gran cantidad de sustancias mediante la reducción del
peróxido a agua, como ocurre con la hidroquinona, uno de
sus posibles sus-tratos:
Para ver la fórmula seleccione la
opción "Descargar" del menú superior
La quinona obtenida es un compuesto de color pardo cuya
concentración es directamente proporcional a la
absorbancia medida a 400 nm, la cual puede utilizarse como medida
de su concentración. Además, la variación de
la absorbancia con el tiempo se
puede tomar como medida de la velocidad de
la reacción.
En los vegetales la peroxidasa, con sus diferentes
formas isoenzimáticas, parece estar relacionada con la
oxidación de numerosos compuestos, proceso que
tiene lugar con mayor intensidad durante la maduración de
los frutos. Estas isoenzimas se encuentran en el interior de
vacuolas celulares que pueden ser detectadas y localizadas
histológicamente con sencillos ensayos de fijación
del enzima en membranas de nitrocelulosa (blotting).
BIBLIOGRAFIA : BIOQUIMICA LEHNINGER, A. CAP. 8 Y
9
Chechetkin, A.V. Prácticas del ganado y las aves
de corral. Editorial Mir, 1984.
– Pequeño Pérez, J. Prácticas de
Fisiología Vegetal. Editorial Pueblo y Educación,
1972.
PARTE
EXPERIMENTAL.
MATERIALES Y REACTIVOS
- pimientos en diferentes estados de maduración
con sus pedúnculos - disolución acuosa de hidroquinona al 0,5 %
(recién preparada) - disolución acuosa de diaminobencidina o
m-fenilendiamina (recién preparada) - disolución acuosa de peróxido de
hidrógeno al 1,5 % (recién preparada) - disolución acuosa de ácido
sulfúrico 2 mol/L - disoluciones buffer de pH 5,0; 6,0;
7,0; 8,0 y 9,0. - membranas de nitrocelulosa 0,45 um
- portaobjetos
- cuchillas o bisturís
PROCEDIMIENTO:
Preparación del extracto enzimático de
peroxidasa.
Prepare 20 ml de un extracto acuoso con 5 g de material
vegetal.
Para ello tome de la masa del pimiento y utilice arena
para triturar la misma. Se deja en reposo durante 10 min y luego
se centrifuga a 4 500 rpm durante 5 minutos o se filtra. El
filtrado obtenido se usará como extracto
enzimático.
EXPERIMENTO # 1.ESTUDIO DEL pH ÓPTIMO DE
ACCIÓN DE LA PEROXIDASA.
- Debe conocerse cuál es el pH óptimo de
trabajo de este enzima. Para ello prepare 4 tubos de ensayo y
añada en ellos 1 ml de una disolución buffer de
pH 5.0,7.0,8.0 y 9.0 respectivamente. - Añada a cada tubo 0.5 ml del extracto
enzimático, 1 ml de hidroquinona y 2 ml de
peróxido de hidrógeno. - Observe los tubos durante 20 minutos para determinar
por los cambios de coloración cuál es el pH
óptimo de la enzima.
EXPERIMENTO # 2.
LOCALIZACIÓN HISTOQUÍMICA DE LAS
ISOENZIMAS DE PEROXIDASA EN PEDÚNCULOS DE
PIMIENTOS.
- La localización histoquímica de la
peroxidasa en los pedúnculos de pimientos será
estudiada imprimiendo una huella de un corte del tejido en
membrana de nitrocelulosa. Para ello deposite cuidadosamente
(sin tocar con los dedos) un pedazo de membrana seca sobre un
portaobjetos. - Imprima sobre ella la huella de un corte de
pedúnculo de pimiento realizado con ayuda de una
cuchilla. Presione suavemente durante 30 segundos antes de
remover el tejido y dejar secar nuevamente la membrana. Realice
esta operación tres veces con muestras diferentes de
tejido. - Una vez seco el pedazo de membrana, realice su
revelado sumergiéndolo en una mezcla de solución
de diaminobencidina, solución de peróxido de
hidrógeno y el buffer elegido para la máxima
actividad enzimática de la peroxidasa, según
el ensayo
anterior, durante l0 minutos. - Después de revelada, la membrana se lava con
agua destilada y se seca finalmente al aire.
REPORTE DE LABORATORIO.
Experimento # 1.
– Informe cuál es el pH óptimo del enzima
peroxidasa y explique por qué lo
escogió.
Experimento # 2.
– Dibuje un esquema con lo observado en el blotting al
pedúnculo de pimiento. Concluya sobre la
localización del enzima en el corte de tejido analizado
(interior cercano a la placenta, exterior cercano a la capa
epidérmica o en todo el tejido).
– Si ha utilizado cortes de pimiento en diferentes
estados de maduración concluya sobre la presencia del
enzima en ellos.
PRACTICA DE LABORATORIO #
4.
ESTUDIO CINETICO DEL ENZIMA
ALFA-AMILASA.
INTRODUCCION.
La cinética enzimática tiene por objeto el
estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por
enzimas, así como los factores que en ella influyen y los
mecanismos por los cuales transcurren.
La velocidad de las reacciones enzimáticas se
puede medir:
– por la cantidad de sustrato que desaparece en la
unidad de tiempo
– por la cantidad de producto que
aparece en la unidad de tiempo
En esta práctica de laboratorio se
comprobará la influencia de la concentración del
sustrato (S), del enzima (E), el pH y la temperatura
(T) en la cinética del enzima alfa-Amilasa salival en su
acción
sobre los enlaces alfa 1-4 del almidón. Para ello nos
basaremos en la desaparición del almidón en la
unidad de tiempo mediante el seguimiento de la reacción de
color que produce el mismo, así como sus productos de
hidrólisis con el Iodo en disolución de Ioduro de
potasio (Reactivo de Lugol).
Dado que el almidón está integrado por dos
fracciones, la amilosa y la amilopectina, debe tenerse en cuenta
las reacciones que ambas producen (así como sus
respectivos productos de hidrólisis) con el reactivo de
Lugol:
AMILOSA AMILOPECTINA
Amilasa Salival
AMILODEXTRINAS
(+IODO Color azul violeta)
ERITRODEXTRINAS
(+IODO Color rojo pardo)
|
MALTOSA + GLUCOSA
DEXTRINAS LIMITES
(+IODO No dan coloración)
Basándonos en las reacciones anteriores podemos
estudiar
Basándonos en las reacciones anteriores podemos
estudiar el efecto que provocan en la cinética
enzimática la variación de los factores que en ella
influyen: c(S), c(E), pH y T, fundamentalmente. La influencia de
la c(E) podremos estudiarla midiendo la velocidad de la
reacción de la forma ya descrita pero utilizando
diferentes c(E), manteniendo constante los demás factores.
De forma similar se procede con el estudio de la influencia de la
c(S). En el caso del estudio de la influencia del pH y la
temperatura se ensayara la actividad del enzima a diferentes
valores de
ambos con la reacción del Lugol.
SUGERENCIA AL ESTUDIANTE:
Responda las siguientes preguntas (si es necesario
consulte y busque en la bibliografía):
1.¿ Cuáles son las características
estructurales del almidón?
2.¿ Qué tipo de enzima es la alfa-Amilasa
salival?
3.¿ Cuáles son los productos que origina
la acción de este enzima sobre el
almidón?
4. Explique cómo influyen en la velocidad de las
reacciones enzimáticas una variación en la
concentración del enzima presente, en la
concentración del sustrato, el pH y la
temperatura.
BIBLIOGRAFIA.
Lehninger. Bioquímica. Págs. 270-272. y
notas de clase.
REACTIVOS.
- Solución del enzima: Se prepara colectando 1
ml de saliva (previo enjuague de la boca con agua destilada) y
diluyéndolo hasta 20 ml con agua destilada. - Disolución de almidón al 0,5
%. - Disolución de Lugol: Se prepara disolviendo 1
g de iodo, 2 g de KI en 200 ml de agua destilada. - Disoluciones tampón de pH 5,0; 6,8 y
8,0. - Tubos de ensayo, placa de porcelana con excavaduras,
vasos de precipitado, baño de agua termostatado,
cronómetro.
EXPERIMENTO # 1:
ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE c(E).
PROCEDIMIENTO:
- Tome 4 tubos de ensayo y añada a cada uno 2 ml
de disolución de almidón al 0,5 %. - Añada a cada tubo 0,1; 0,2; 0,3 y 0,4 ml de
disolución del enzima respectivamente, y complete hasta
un volumen de 0,5
ml con agua. Añada primero el agua y
luego la disolución del enzima, pues de lo contrario la
reacción comenzará a verificarse y usted no
tendrá en cuenta el tiempo transcurrido.
Inmediatamente después de adicionar la solución
del enzima al último tubo ponga en marcha el
cronómetro y comience a medir el tiempo del
experimento. - En cada intervalo de 1 minuto ensaye en la placa con
excavadura la reacción de la solución
experimental con el Lugol: para ello sólo tiene que
extraer con el gotero pequeñas cantidades de cada tubo
de ensayo en reacción a una excavadura de la placa y
luego adicionar una gota del reactivo de Lugol. Observe y anote
el color para cada tiempo y cada tubo ensayados. - Determine por el procedimiento anterior el tiempo que
tarda cada uno de los tubos en no dar reacción alguna
con el reactivo de Lugol, la mezcla de las dos gotas debe
quedarse del color original del Lugol. Si desea puede adicionar
en una excavadura unas gotas de agua y Lugol para tenerlo como
solución de control. - Con los datos obtenidos
construya la siguiente tabla:
TUBOS 1 2 3 4
Volumen de enzima (ml)
Tiempo total de reacción (min)
Velocidad de la reacción (1/t)
6. Con estos datos construya un gráfico de c(E)
en el eje ordenado contra velocidad de reacción (1/t) en
el eje de abscisas.
EXPERIMENTO # 2: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DEL
pH.
PROCEDIMIENTO:
- En 3 tubos de ensayo vierta respectivamente 2 ml de
las soluciones
tampones de pH 5,0; 6,8 y 8,0. - Añada a cada tubo 2 ml de la solución
del almidón al 0,5% y 2 ml de la solución del
enzima. Incube a 40 grados Celsius y ensaye la reacción
con el Lugol según se indica en el trabajo
experimental # 1. - Con los datos obtenidos extraiga las conclusiones
sobre el rango de pH en el cual el enzima muestra su actividad
óptima.
EXPERIMENTO # 3: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE
c(S).
PROCEDIMIENTO:
- Tome 4 tubos de ensayo y añada a cada uno 0,5;
1,0; 1,5 y 2,0 ml de solución de almidón.
Complete el volumen de cada tubo hasta 2,0 ml con agua
destilada. - Adicione a cada tubo 0,5 ml de disolución del
enzima Alfa amilasa e incúbelos a 40 grados
Celsius. - A intervalos de 1 minuto ensaye la presencia de
almidón mediante la reacción con Lugol de forma
similar a como se describe en el trabajo experimental #
1.TUBOS 1 2 3 4
Volumen de sustrato (ml)
Tiempo total de reacción (min)
Velocidad de reacción (volumen /
tiempo) - Con los datos obtenidos construya la siguiente
tabla: - Con los datos de la tabla construya un gráfico
de velocidad de reacción (volumen / tiempo) en el eje
ordenado contra volumen de sustrato en el eje de abscisas (que
representa concentración de sustrato creciente en
nuestro experimento).
EXPERIMENTO # 4: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LA
TEMPERA TURA.
PROCEDIMIENTO:
- En 5 tubos de ensayo añada 5 ml de
disolución de almidón al 0,5% y 1 ml de
solución de enzima. - Hierva durante 5 min y reponga el volumen de agua
perdida por evaporación en uno de los tubos.
Incúbelo a 40 grados Celsius y ensaye de la forma
estudiada la presencia de almidón en él a
diferentes intervalos de tiempo. - Incube un segundo tubo a 40 grados Celsius y un
tercero a 50 grados Celsius, y ensaye en ellos la
reacción con Lugol a intervalos de 1 minuto. Anote el
tiempo que se demora en desaparecer la coloración
azul. - Un cuarto tupo incúbelo en un baño de
hielo y ensaye también la reacción con
Lugol. - El último tubo déjelo a temperatura
ambiente del
laboratorio y ensaye con el Lugol hasta la desaparición
de la reacción positiva en intervalos de 1
minuto. - Con los datos obtenidos en el ensayo complete la
siguiente tabla, y extraiga sus conclusiones:
Color observado a diferentes tiempos (min)
5 10 15 20 25 30
Tubos
1
2
3
4
5
REPORTE DE LABORATORIO.
Experimento # 1: Estudio de la influencia de la
concentración del enzima.
1. Describa qué características
estructurales del almidón permiten su
identificación mediante las disoluciones de yodo, y el
efecto de la amilasa salival sobre los enlaces del
almidón.
2. Anexe la tabla y el gráfico de velocidad de
reacción contra c(E), tomando como concentración
del enzima el volumen de la solución utilizado en cada
tubo. ¿Por qué se puede tomar como velocidad de
reacción el inverso del tiempo?
3. Plantee las conclusiones a que puede arribar de los
resultados del experimento.
4. Resuma las dificultades encontradas en el
ensayo.
Experimento # 2: Estudio de la influencia del
pH.
1. Describa lo observado al realizar el estudio de la
influencia del pH en la velocidad de reacción del enzima
alfa-Amilasa. ¿A qué conclusión llega acerca
del pH óptimo de este enzima?
2.¿ Qué efecto tendría la
utilización del medio con pH muy ácido o muy
básico en la realización de este ensayo?
Experimento # 3: Estudio de la influencia de la
concentración del sustrato.
1. Anexe la tabla y el gráfico elaborados
según las indicaciones del trabajo práctico,
tomando como valor de c(S) el del volumen del mismo medido en
cada tubo. ¿Por qué en este caso para calcular la
velocidad de la reacción es necesario dividir el volumen
de sustrato entre el tiempo?
2. Analice el gráfico y plantee las conclusiones
a que puede llegaren este caso.
3. Describa las dificultades presentadas en este
ensayo.
Experimento # 4: Estudio de la influencia de la
temperatura.
1. Anexe la tabla resumen de los resultados del
experimento según las indicaciones del trabajo
práctico.
2. Explique qué le sucede al enzima del tubo que
se hierve antes de incubarlo a 40 grados Celsius.
3. Plantee las conclusiones a que pudo arribar en este
ensayo. ¿Por qué no se debe emplear el
término de temperatura óptima?
PRACTICA DE LABORATORIO #
5.
ACCION HIDROLITICA DE LAS AMILASAS DE SEMILLAS
DE GRAMINEAS
INTRODUCCION
Las fuentes más importantes como materia prima
para la obtención de energía son los
polisacáridos, el almidón y el glucógeno. En
los vegetales el almidón constituye el polisacárido
de reserva más abundante, sintetizándose en los
cloroplastos de las células fotosintéticas y en los
amiloplastos de las células del parénquima de
almacenamiento.
El camino típico para la movilización del
almidón de reserva es a través de la actividad
hidrolítica de las alfa y beta amilasas, cuya
acción conduce a la formación de maltosa. El
desdoblamiento de la maltosa hasta glucosa está a cargo de
la maltasa, que se encuentra junto con las amilasas.
Las amilasas pueden extraerse de los granos de cereales
en germinación mediante maceración con agua. Su
acción hidrolítica puede seguirse mediante los
reactivos de Lugol y de Fehling.
BIBLIOGRAFIA PARA LA AUTO PREPARACIÓN:
LEHNINGER. ALBERT. BIOQUIMICA. Capítulos 8 Y 10
Páginas 189, 270 – 272.
PARTE EXPERIMENTAL
REACTIVOS:
– Semillas de gramíneas en
germinación
– Mortero.
– Cristalería.
– Termostato.
– Reactivos de Lugol, Fehling, Tollens y
Benedict.
– Mechero.
PROCEDIMIENTO:
- Prepare 30 mL de un macerado acuoso con 10 g de
semillas de gramíneas germinadas teniendo en cuenta que
el agua debe estar caliente (50 grados). Añada 5 gotas
de glicerina para extraer lo más posible los
enzimas. - Deje reposar de 15 – 20 minutos de 30 – 45 grados
Celsius y filtre el extracto. - En un tubo de ensayo, introduzca 5 ml de
disolución de almidón y de 1 – 2 ml del extracto.
A intervalos de 5 minutos, comprobar la degradación del
almidón por las amilasas ensayando una muestra del
sistema de
reacción en una placa con excavaduras con el reactivo de
Lugol. Para reconocer la presencia de azúcares
reductores (maltosa y glucosa), realizar la reacción con
los reactivos de Fehling, Tollens o Benedict de una muestra de
1 – 2 ml del sistema de reacción.
REPORTE DE LABORATORIO
1- Represente a través de una ecuación la
acción hidrolítica de las amilasas del
almidón (amilosa).
Nota : Utilice las estructuras
químicas.
2- Clasifique las amilasas de acuerdo con el Sistema
Internacional.
3-¿ Qué objetivo
persigue realizar la reacción con el reactivo de Lugol
cada cierto intervalo de tiempo?
4-¿ Qué objetivo persigue realizar al
final del experimento la reacción con el reactivo de
Fehling? Represente la ecuación.
PRACTICA DE LABORATORIO #
6.
ACCION HIDROLITICA DE LAS LIPASAS DE
SEMILLAS DE OLEAGINOSAS
INTRODUCCION
Las grasas, al
igual que el almidón son sustancias de reserva de las
plantas y se almacenan principalmente en las semillas.
Cerca del 20 % de las plantas contienen grasas en las
semillas como principal sustancia de reserva. Entre estas se
encuentran el girasol, maní, palmiche, soja, en las
cuales puede acumularse del 20 al 60 % del peso seco.
Para su utilización como fuente de
energía, los mismos deben experimentar hidrólisis
por acción de las lipasas presentes en las semillas por
cuya acción se convierten en ácidos
grasos y glicerol, siendo su pH óptimo entre 4,7 y
5,0.
H 2 O
triacilglicérido ácido graso +
glicerol
lipasa
La actividad de las lipasas se puede determinar por la
valoración con alcohol de los ácidos grasos
producidos.
BIBLIOGRAFIA PARA LA AUTO PREPARACIÓN:
LEHNINGER. ALBERT A. BIOQUIMICA.
PARTE EXPERIMENTAL
Represente mediante una ecuación química
la hidrólisis de los
triacilglicéridos.
REACTIVOS:
- Semillas de higuereta, maní o
soja. - HAc 0,1 mol/L.
- Etanol.
- NaOH 0,1 mol/L.
- Fenolftaleína.
- Cristalería.
PROCEDIMIENTO:
- Disponga de tres frascos Erlenmeyer numerados e
introduzca en cada uno 3 g de semillas oleaginosas desprovistas
de sus cubiertas y trituradas. Añada a cada uno 10 ml de
agua destilada. - En el frasco 1 añada 2 ml de HAc 0,1 mol/L. En
el frasco 2 hierva su contenido durante 5 minutos y luego
agregue 2 ml de HAc. - Para eliminar los procesos de putrefacción
añada 2 gotas de tolueno en los tres frascos, tape y
coloque en un termostato a 35 – 37 grados hasta el día
siguiente. - Al día siguiente añada a cada frasco 10
ml de etanol para eliminar la disociación
hidrolítica del jabón que se forma durante la
valoración y en el frasco 3 agregue 2 ml de HAc 0,1
mol/L para igualar las condiciones del ensayo. - Valore con NaOH 0,1 mol/L los ácidos grasos
producidos en los tres frascos por acción de las
lipasas. Anote el volumen gastado en cada caso y analice lo
ocurrido.
REPORTE DE LABORATORIO:
INTRODUCCIÓN
La reacción de transaminación es
probablemente una de las más difundidas en el metabolismo de
los aminoácidos, su descubrimiento se debe a los
científicos Braunstein y Kritzmann en el año
1938.
En esta reacción el grupo alfa-amino de un
aminoácido es transferido al átomo de
carbono alfa
de un alfa cetoácido, dando lugar al correspondiente alfa
cetoácido análogo al aminoácido y el
aminoácido análogo al cetoácido
correspondiente.
Se conocen un gran número de transaminasas. En la
práctica de laboratorio se comprobará la
transaminasa glutámico – pirúvica (GAT), la que
cataliza la siguiente reacción:
O
_ _ _
OOC- (CH 2) 2- CH-COO + H
3 C-C-COO
NH 3 +
glutamato l piruvato
/
H
_ _ _
OOC- CH 2-CH 2 – C – COO + H
3 C- C – COO
O NH 3 +
alfacetoglutarato alanina
En la práctica el arsenito de sodio se
utilizará para evitar la descarboxilación oxidativa
del piruvato. El ácido tricloroacético y el etanol
actúan como agentes desnaturalizantes.
BIBLIOGRAFIA: LEHNINGER. ALBERT L. BIOQUIMICA. CAP 21.
págs 574-577.
MATERIALES Y REACTIVOS:
- Arsenito de sodio 0,1 mol/L.
- Buffer fosfato pH = 7,4.
- Alanina 0,01 mol/L.
- Ninhidrina 0,2 % en etanol al 95 %.
- Glutamato de sodio 0,2 mol/L y 0,01
mol/L. - Alfacetoglutarato 0,01 mol/L.
- Solución semisaturada de 2,4
dinitrofenilhidracina en HCL 0,1 mol/L. - Solvente para cromatografía de
cetoácidos: - 7 ml de N-Butanol.
- 2 ml de NH4OH.
- 1 ml de Etanol.
- Solvente para cromatografía de
aminoácidos:
Fenol-agua 80 %.
PROCEDIMIENTO:
OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS DE ENZIMAS:
1- Prepare un extracto de hígado en la
proporción 1:5 en masa volumen con buffer fosfato pH 7,4.
Utilice baño de hielo para realizar la
operación.
2- Centrifugue a 2500 rpm durante tres minutos o filtre
a través de una gasa doble o algodón.
3- Guarde el sobrenadante en un tubo sumergido en
baño de hielo y rotúrelo como extracto de
hígado (E.H-1).
4- Tome la mitad del extracto y páselo a un tubo
y colóquelo en un baño de agua hirviendo durante 5
minutos. Rotúrelo como extracto de hígado calentado
(E.H.C-2).
DESARROLLO DE LA REACCION:
Con los extractos anteriores prepare dos tubos de ensayo
de la siguiente forma:
Tubo 1 Tubo 2
______________________________________________________________
Arsenito de sodio 0,1 mol/L. 0,2 0,2
Glutamato de sodio 0,2 mol/L. 0,15 0,15
Piruvato de sodio 0,2 mol/L. 0,15 0,15
Extracto de hígado (1). 0,5 –
Extracto de hígado calentado (2). –
0,5
________________________________________________________________
- Incube los tubos a 37 grados durante 30 minutos para
el transcurso de la reacción. - Una vez transcurrido el tiempo añádale
4 ml de etanol a cada tubo. - Centrifugue a 2500 rpm durante 3 minutos. Guarde el
sobrenadante para su identificación
cromatográfica.
CROMATOGRAFIA DE AMINOACIDOS:
- Prepare el papel cromatográfico y aplique con
un capilar las muestras del tubo 1 y 2 y los patrones de
ácido glutámico y alanina, identificando a cada
una en el borde superior del papel. - Coloque el papel en la cámara
cromatográfica y deje correr la cromatografía
hasta una altura de 5 cm como mínimo. - Extraiga el papel y séquelo al aire. Rosee el
mismo con ninhidrina y colóquelo en la estufa hasta la
aparición de las manchas. - Calcule los Rf de las muestras y patrones y analice
comparativamente los resultados de los tubos 1 y 2.
CROMATOGRAFIA DE CETOACIDOS:
- Primeramente se formarán las
dinitrofenilhidrazonas de los cetoácidos y luego se
realizará la cromatografía.1 2 3 4
________________________________________________________________
Disolución de
2,4 dinitrofenilhidracina. 0,1 0,1 0,1
0,1Sobrenadante del tubo 1. 0,1 – – –
Sobrenadante del tubo 2. – 0,1 – –
Piruvato 0,2 mol/L – – 0,1 –
alfa-cetoglutarato 0,2 mol/L. – – – 0,1
________________________________________________________________
Deje en reposo 10 minutos para que transcurra la
reacción.Aplique en el papel cromatográfico los
sobrenadantes de los cuatro tubos anteriores,
identificándolos adecuadamente.Coloque el cromatograma en la cámara y
déjelo correr hasta una altura de 5 cm como
mínimo.Extraiga el papel y séquelo al
aire.Calcule los Rf de las muestras y patrones y analice
comparativamente los resultadosREPORTE DE LABORATORIO
1- Calcule los Rf de los
aminoácidos patrones y muestras e identifique los que
están presentes en las muestras.2- Calcule los Rf de los cetoácidos,
identifique los que están presentes en las
muestras. - Para formar las dinitrofenilhidrazonas prepare cuatro
tubos de ensayo de la siguiente forma: - Haga un análisis de los resultados comparando los
resultados de los tubos 1 y 2 y llegando a conclusiones acerca
de los productos obtenidos en la reacción de
transaminación.
PRACTICA DE LABORATORIO #
8
RESPIRACION EN CELULAS VEGETALES
La respiración, proceso metabólico
mediante el cuál los organismos aerobios obtienen
energía, consta de tres fases:
-ciclo de Krebs, -cadena respiratoria,
-fosforilación oxidativa
Durante la misma se produce la formación de
dióxido de carbono, agua y parte de la energía
liberada se utiliza para la formación de ATP.
Este proceso se alimenta de un importante metabolito, la
AcetilCoenzima A, compuesto que puede proceder de la
degradación de sacáridos, lípidos y
proteínas. Dentro de los glúcidos se destaca el
almidón por su abundancia.
El proceso respiratorio es contínuo en todas las
células aerobias y en los vegetales se lleva a cabo tanto
en raíces como en tallos, hojas, flores y semillas. Estas
últimas constituyen un importante reservorio de sustancias
oxidables entre las que se destacan el almidón y las
grasas.
Cuando las semillas germinan, degradan una importante
parte de estas sustancias. El almidón se convierte por la
acción de la amilasa y las diastasas en glucosa la
cuál se degrada por la combinación de la
glucólisis y la respiración hasta dióxido de
carbono y agua.
La producción de dióxido de carbono se
puede cuantificar mediante su reacción con
hidróxido de bario según la
ecuación:
Ba(OH) 2 + CO 2 BaCO 3
+ H 2 O
El exceso de hidróxido de bario se titula con
ácido oxálico y de esta forma se puede calcular la
intensidad respiratoria de las semillas.
PARTE EXPERIMENTAL
REACTIVOS:
- semillas germinadas de gramínea
- erlenmeyers de 250 ml y bolsa de tela
metálica - disolución de Ba(OH)2 c(n/z*) 0.1
mol/l - disolución de Ácido Oxálico
c(n/z*) 0.1 mol/l - disolución de fenolftaleína
PROCEDIMIENTO:
I- COMPROBACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE
CO2 DURANTE LA RESPIRACIÓN.
- En una bolsa de tela metálica se colocan de 5
a 10 g de semillas germinadas y se cuelgan del gancho del
tapón como aparece en la figura - Anote la masa de semilla pesadas en una balanza
técnica y denótelo como "c". - En el erlenmeyer se introducen 25 ml de la
disolución de Ba(OH)2 y se tapa con el tapón en
que están colocadas las semillas germinadas. Se dejan en
el puesto de trabajo durante una hora. Periódicamente se
agita el mismo para facilitar la reacción del
CO2 desprendido. - Paralelamente se prepara otro erlenmeyer que contenga
25 ml de Ba(OH)2 y se tapa, el cuál se
utilizará como testigo. - Después de transcurrida la hora se valoran los
dos erlenmeyers con Ácido Oxálico previa
adición de 2 ó 3 gotas de
fenolftaleína. - Anote los volúmenes de ácido consumido
en la valoración del erlenmeyer que contenía las
semillas (b) y en el erlenmeyer testigo (a).
II-COMPROBACIÓN DE LA DEGRADACIÓN DEL
ALMIDÓN EN LASA SEMILLAS EN
GERMINACIÓN.
REACTIVOS:
- gramíneas germinadas y sin
germinar - reactivos para la identificación de
almidón - reactivos para la identificación de
sacáridos reductores
- Prepare 30 ml de extractos acuosos de semillas
germinadas y sin germinar por separado. - Ensaye la presencia de almidón en ambos
extractos utilizando el método conocido anteriormente en
la asignatura de Bioorgánica. - Puede remitirse a la bibliografía
orientada. - Anote los resultados obtenidos.
- Ensaye la presencia de sacáridos reductores en
ambos extractos de semillas utilizando métodos conocidos
anteriormente. Puede remitirse a la bibliografía
orientada. - Anote los resultados obtenidos.
REPORTE DE LABORATORIO
I- Realice el cálculo de
la intensidad respiratoria teniendo en cuenta los datos obtenidos
del experimento.
a = ml de ácido oxálico consumidos en la
valoración del frasco testigo (sin semillas)
b = ml de ácido oxálico consumidos en la
valoración del frasco con las semillas
c = masa de semillas (gramos)
X = Intensidad respiratoria. mg de dióxido de
carbono desprendido por gramo de semilla
2,2 (a – b)
X = —————-
c
2,2 = 1 ml de ácido oxálico c(x/z*) 0,1
mol/l equivale a 2,2 mg de dióxido de carbono
desprendido
Explique en que etapas de la respiración se forma
el Dióxido de carbono desprendido.
II- Elabore una tabla donde aparezcan los resultados
obtenidos en la identificación del almidón y los
sacáridos reductores en los extractos de semillas
germinadas y sin germinar.
Analice comparativamente los resultados obtenidos para
ambos extractos y justifique los mismos.
Proponga un esquema resumen que integre la
explicación de lo observado en los experimentos I y
II.
- Brewster, R.Q..Curso práctico de
Química Orgánica . 2da edición . Editorial MIR . Moscú
1977. - Chechetkin, A.V.; Voronianski V.I.; Pokusay,
G.G..Práctcas de Bioquímica del ganado y aves de
corral. Editorial MIR. Moscú 1984. - Lehninger, A.. Bioquímica . Editorial Pueblo y
Educación . La Habana . 1985. - Pequeño Pérez , J. Prácticas de
Fisiología Vegetal . Editorial Pueblo y Educación
, La Habana 1972.
Autores
M Sc. Tamahara Fernández
Iglesias
Dr C. Armando Roca Serrano
M Sc. Maritza Ulloa Román
M Sc. Pablo Bahr Valcárcel
2002