- Caracteristicas
generales - Clasificacion
- Estructura Antigenica
- Patogénesis del genero
Haemophilus - Epidemiologia y control
- Medios y condiciones de
incubación - Tratamiento
- Bibliografía
TAXONOMIA
FAMILIA: PASTEURELLACEAE.
GENERO: HAEMOPHILUS
ESPECIES: Haemophilus
influenzae
Haemophilus parainfluenzae
Haemophilus haemoliticus
Haemophilus parahemoliticus
Haemophilus aphrophilus
Haemophilus paraphrophilus
Haemophilus segnis
Haemophilus ducreyi
Haemophilus aegyptus
Coco bacilos Gram
negativos.
Son
pleomórficos
Son
inmóviles.
Tamaño: 0.4 mm de ancho x 1 mm de
largo.
Se agrupan a menudo
en cadenas cortas y bacilos aislados o bien
filamentosos
No forman
esporas.
No pose
cilios.
Algunas espacies son
capsuladas.
Es una bacteria anaerobia
facultativa
Temperatura
óptima de crecimiento a 37
- Algunas especies de Haemophilus requieren factores
de crecimiento que están presentes en la sangre como
factor X y factor V. - Algunos producen hemólisis como
Haemophilus haemolyticus y Haemophilus
parahaemolyticus.
- Se han descrito 19 especies distintas dentro del
género Haemophilus y estos se han clasificado
basándose en las necesidades para su crecimiento, pero
solo 9 especies del género son humanas. - Algunas especies requieren factor X que es un grupo de
compuestos tetrapirrolicos termoestables que son proporcionados
por diversos pigmentos que contienen hierro por
ejemplo: Hemina y Hematina. - Los compuestos de factor X se usan en la síntesis
de Catalasas Peroxidasas y el Sistema de
transporte
de electrones de citocromo. - Los microorganismos que dependen del factor X para su
crecimiento son capaces de sintetizar protocorfilina a partir
de ácidos
alfa aminolevelinico. Una reacción que sirve como base
para detectar cepas de Haemophilus. - Algunas especies de Haemophilus pueden también
requerir factor V (dinucleótido de nicotidamina y
adenina). - Las especies de Haemophilus dependiente del factor V no
crecen generalmente en agar-sangre de rutina en el cual los
eritrocitos están intactos. - Pueden usarse medios que
contienen eritrocitos lisados como agar chocolate o agar sangre
con 5% de sangre no lisada de caballo o conejo y medio con
suplemento de fildes para la recuperación de especies de
Haemophilus de muestras clínicas. - La especies humanas de Haemophilus se asocian con las
vías respiratorias altas con excepción del
Haemophilus ducreyi que causa una enfermedad de
transmisión sexual denominada Chancroide. - Las especies de Haemophilus recuperadas de muestras
humanas se identifican en el laboratorio
clínico por la demostración del requerimiento del
factor X y V, reacciones hemolíticas en agar-sangre de
caballo, producción de catalasa y oxidasa y
mediante la realización de diversas pruebas
bioquímicas de rutina, que incluyen producción de
indol, actividad de ureasa, actividad de ornitina de
decarboxilasa.
El Haemophilus influenzae posee en sus envolturas 3 factores
antigénicos importantes ellos son:
- El polisacárido capsular
- El LPS (endotoxina)
- La proteína de la membrana externa (proteasas de
Ig A humanas)
- Los componentes más importantes son: el
polisacárido capsular y la endotoxina. - Estos seria responsables de la virulencia, adherencia y
resistencia a
la fagocitosis. - Estos microorganismos también elaboran proteasas de
Ig A que son enzimas capaces
de hidrolizar la cadena pesada de Ig A1 humana. - Como se fija a las mocosas donde el mecanismo
inmunológico esta mediado por Ig A, su clivaje puede
ayudar a la virulencia del microorganismo.
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PATOGÉNESIS DEL
GENERO
HAEMOPHILUS
- Forman parte de la flora normal de tracto
respiratorio y ocasionalmente del tracto genito urinario del
hombre. - Pueden causar infecciones del tracto respiratorio
superior, infecciones supurativas sobre todo en zonas
adyacentes al tracto respiratorio e infecciones
sistémicas.
HAEMOPHILUS INFLUENZAE TIPO B
CAPSULADO
Para
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- Es el agente etiológico mas común de
meningitis bacteriana en niños
de1 mes a 4 años de edad. - La colonización nasofaringea previa en un
huésped susceptible llevan a la invasión del
torrente circulatorio y a la posterior siembra en las
meninges. - Haemophilus influenzae, la especie patógena
más importante del género, también esta
asociada a infecciones como epiglotitis, celulitis, artritis
séptica y neumonía.
Manifestaciones clínicas de
infección invasiva por Hib
Hib: colonización en el
hombre
Haemophilus influenzae tipo b. Celulitis de brazo y
pie.
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HAEMOPHILUS INFLUENZAE NO
CAPSULADO
Estos microorganismos están asociados a las
siguientes patologías:
Bronquitis
crónica.
Otitis
media.
Sinusitis.
Conjuntivitis.
MECANISMO DE TRANSMISIÓN: Es por
vía inhalatoria a partir de los casos activos, de los
convalecientes o de los portadores. Así los
microorganismos penetran a los tejidos por
vías respiratorias superiores.
FUENTE DE INFECCIÓN: Es el hombre. La
incidencia del estado de
portador es del alrededor del 70% en niños pequeños
y del 35% en adultos, pero pueden ser aún mayor
según la época del año.
DISTRIBUCIÓN GEOGRAFICA: Las infecciones
por este microorganismo ocurren en todo el mundo sobre todo en
zonas de bajos recursos
económicos.
Enfermedad por Hib: factores de
riesgo
PREVENCIÓN: Se puede prevenir
por administración de vacuna conjugada. Los
niños de 2 meses de edad o mayores pueden inmunizarse con
vacunas de
Haemophilus tipo b con uno de sus dos portadores:
- Proteína portadora de Corynebacterium mutante
(proteína de la toxina)
Con el complejo de
membrana externa de Neisseria meningitidis.
RECOGIDA DE MUESTRA.
-
Se recogerá en un recipiente estéril
de tapa bien ajustada y segura, se enviara al laboratorio sin
demora para procesar la muestra. La muestra que no se procesa
de inmediato se pude refrigerar por 3 horas. - Esputo:
Obtenida por el medio en que recipiente
estéril proporcionado por el laboratorio, la muestra
debe procesares de inmediato. - LCR.
- Hisopado de garganta, Secreciones
faríngeas.
Es necesario que el paciente este en ayunas la muestra
debe tomarse con sumo cuidado, debe:
- Colocar al paciente sentado y pedirle que trague
saliva fuertemente dos veces. - Pedir al paciente que abra la boca y saque la
lengua. - Con un baja lenguas, presionar fuertemente la lengua
hacia abajo simultáneamente iluminar bien el fondo de la
lengua. - Localizar en el fondo de la garganta y en las
amígdalas los lugares de
lesiones. - Con un hisopo estéril frotar firmemente las
lesiones con sumo cuidado de no tocar la lengua, la campanita,
los carrillos o los labios al retirar el hisopo.
- Otras muestras.
- Sangre
- Secreciones de ulceras genitas
- Hisopado conjuntival
- Aspirado de oído medio.
Transporte de la
muestra
- El hisopado y secreciones.
Se debe remitir al laboratorio de inmediato, si la muestra
no se procesa en un plazo de tres horas colocara en un medio de
transporte como Amies o Stuart.
- Esputo.
Debe enviarse de inmediato al laboratorio, si se deja en
reposo después de recogerlo puede producirse una
proliferación de bacterias
contaminantes que haga sumamente engañosos los
resultados.
Medios y condiciones
de incubación para Haemophilus
1. Agar chocolate
2. Técnicas
de la estría de estafilococicos.
3. Agar sangre de Casman y disco de
bacitracina de 10 microgramos
4. Agar de Levinthal o agar de
enriquecimiento de fildes
1. AGAR CHOCOLATE
Este puede repararse calentando una
base de agar de sangre estéril a una temperatura
(alrededor de 80ºC) suficientemente alta como para lisar
los eritrocitos de carnero y liberar los factores de x y
v.
Debe evitarse el calentamiento prologado el factor V es
termolábil.
También se puede comprar el agar chocolate de
proveedores
comerciales que estén mejor preparados para estandarizar
el contenido de los productos.
Este agar habitualmente es una mezcla sintética de
hemoglobina (factor x) y un "cócktail" de factores de
crecimiento.
El agar chocolate tiene la desventaja
de que no puede determinar las propiedades hemolíticas
del Haemophilus haemolyticus y Haemophilus
parahaemolyticus
Se requiere experiencia para
visualizar colonias de Haemophilus, ya que tiene un aspecto
blanco grisáceo semi opaco ligeramente
mucoide.
2 .Técnica de la estría de
estafilococos.
- Las especies de Haemophilus que requieren factor V
pueden aparecer como pequeñas colonias que asemejan
gotas de rocio dentro de las zonas de producción de NAD
(Factor V) alrededor de las colonias de otras bacterias.
- Esta técnica es particularmente adaptable al
aislamiento de Haemophilus influenzae de LCR, sangre u
otro tipo de muestra. - Puede efectuarse una identificación presuntiva
de los microorganismos en cultivo de material faringeo y esputo
haciendo una estría estafilococcica a través del
área de la segunda estría.
PRUEBA DE SATELITISMO
El crecimiento de Haemophilus se logra en
agar chocolate ya que los factores de crecimiento se
encuentran libres en el medio.
Se inocula agar chocolate luego
incubarlo de 18-24 horas en jarra con candela.
Observamos colonias muy
pequeñas puntiformes, traslúcidas y ligeramente
mucosas.
- Hacemos frotis y se colorea con Gram para observar si
predominan cocos bacilos Gram negativos
pleomórficos.
Tomar una asada del crecimiento en
agar chocolate y estriar en el centro de agar sangre de carnero
5% solo en una dirección.
- En sentido perpendicular a la estría efectuada
hacer una estría de Staphylococcus aureus, recta
y a lo largo de toda la caja. - Incubar el agar sangre de 24 a 48 horas a 36º C.
en jarra húmeda con candela. - Una prueba positiva de satelitismo consiste en el
crecimiento de las pequeñas colonias de Haemophilus solo
muy cerca de la estría de Staphylococcus
aureus.
Se debe hacer un frotis coloreado por Gram para confirmar
la morfología.
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3. Agar Sangre de casman y disco bacitracina de 10
mg/ml
- El agar sangre de carnero con aplicación de un
disco de bacitracina de 10 microgramos en el área
más abundante inoculada provee un excelente método
para aislamiento de Haemophilus - Sobre todo a partir de muestras en las que se puede
anticipar un desarrollo
confuso de bacterias mixtas.
Haemophilus se
puede reconocer por su desarrollo alrededor del disco de
bacitracina en agar Casman
- Los componentes del medio agar sangre de Casman son:
peptona, extracto de carne, cloruro de sodio y agar al 2.5 %
para acrecentar el desarrollo de las especies de
Haemophilus.
El disco de bacitracina inhibe el
desarrollo de muchas bacterias grampositivas comúnmente
halladas en cultivos mixtos.
Placas de agar sangre equina preparadas con medio base
de Casman y discos de bacitracina de 10 microgramos. Este medio
enriquece el desarrollo de especies de Haemophilus. El disco de
bacitracina inhibe el desarrollo de la mayoría de
bacterias comensales halladas en las secreciones de las
vías respiratorias superiores.
4. AGAR CON ENRIQUECIMIENTO DE FILDES.
Es un digerido peptídico de sangre ovina que
puede obtenerse en el mercado e
incorporarse al agar para el aislamiento de
Haemophilus
Este agar contiene factor VyX lo que
evita la necesidad de agregar sangre entera al medio, este
enriquecimiento en general se agrega a una base de
infusión de cerebro
corazón o ATS con concentración al
5% lo que da como resultado un medio
traslúcido.
No pueden determinarse propiedades
hemolíticas en medios sin sangre con el enriquecimiento
de fildes por que no hay eritrocitos enteros.
Usos: sirve como suplementos de medios
para pruebas de susceptibilidad antimicrobiana para
microorganismos exigentes.
Características utilizadas para identificar
Haemophilus.
Se utilizan tres categorías para identificar las
especies de importancia clínica que son:
- Reacción hemolítica en sangre de
caballo - La necesidad del factor V
- Requerimiento del factor X para el
desarrollo.
Hay otras características
utilizadas como la necesidad de mayor tensión de
CO2
Producción de indol
El factor X (Hemina) y el factor V
(NAD) son requeridos en forma separada o combinada para
promover el desarrollo de varias especies de
Haemophilus.
- El organismo en estudio se inocula por estrías
en un medio deficiente de factores X y V. - Estos agares deficientes de estos factores
son: - Agar Muller Hilton o agar tripticasa
soya. - Las tiras o discos de papel filtro impregnados con
los factores V y X se aplican a la superficie del agar
inoculado y se observan los patrones de desarrollo alrededor de
las tiras de papel.
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BIOTIPIFICACION DE HAEMOPHILUS
INFLUENZAE Y HAEMOPHILUS PARA INFLUENZAE
El estudio taxonómico del género Haemophilus
introdujo el uso de pruebas bioquímicas para la
identificación y caracterización de estos
microorganismos. Sobre la base de tres pruebas:
- Producción de indol
- Producción de urea
- Producción ornitina descarboxilasa
Condiciones de
incubación.
Las placas para requerimiento de
factor X y V se incuban con 5 a 10 % de CO2 a
35º C durante 18 -24 horas y se observan los patrones de
desarrollo alrededor de las tiras.
También se utiliza el
método de estrías de Staphylococcus aureus
para determinar los factores V y X que requieren otros medios
de agar:
1. Un medio deficiente de factor V y X (Muller
Hinton)
2. Un medio de agar sangre que solo tenga factor X, como
agar chocolate que se ha mantenido a 60º C para lisar los
GR.
- Cada uno de los medios se estría con una
cepa de Staphylococcus aureus productora de factor
V. - Luego de inocular la superficie del agar con la
muestra, se incuba a 37oC en
CO2
- Cada uno de los medios se estría con una
- El desarrollo de colonias en agar sangre indica
necesidad de factor X únicamente. - La presencia de desarrollo solamente cerca de la
estría de Staphylococcus en agar sangre indica
requerimiento de ambos factores.
Si el desarrollo se observa solo cerca
de la estría de Staphylococcus en ambos medios la
especie solo necesita factor V.
PRUEBA DE LAS
PORFIRINAS
También se puede utilizar la prueba de la porfirina
que es para detectar cepas de Haemophilus dependientes del factor
X, basada en el principio de que la cepa carece de la enzima
porfobilinógeno sintetasa que transporta el ácido
gamma aminolebulinico en porfobilinógeno, por lo tanto la
detención de porfobilinógeno o porfirinas en el
sustrato de la prueba indica que la bacteria es capaz de efectuar
la síntesis endógena del hemo y no requiere una
fuente exógena de factor X.
TÉCNICA
Se suspende una asada del
microorganismo en 0.5 ml de sustrato
enzimático.
Se incuba 35 º C durante 4 horas
(Suspensión concentrada)
Si la concentración es diluida
incubar de 18 a 24 horas
- Se añade reactivo de Erlich
INTERPRETACIÓN
La aparición de color rojo
en la fase acuosa indica la presencia de
porfobilinógeno, una prueba positiva indica que el
organismo no requiere de factor X:
Prueba de la Porfirina. El tubo de
la izquierda muestra una prueba positiva (color rosado) comparado
con el control negativo
de la derecha. Los tubos contienen un sustrato compuesto por
clorhidrato de ácido gamma-aminolevulínico. Los
microorganismos que no requieren factor X son capaces de
sintetizar porfobilinógeno a partir del ácido
levulínico del sustrato que produce un color rojo en la
fase acuosa cuando reacciona con el reactivo de
Ehrlich
IDENTIFICACIÓN RÁPIDA
PARA HAEMOPHILUS INFLUENZAE TIPO "b"
- La importancia clínica de Haemophilus influenzae
tipo b ha estimulado el desarrollo de métodos
inmunológicos rápidos para la detección
del polisacárido capsular directamente en las muestras
clínicas como LCR, suero y orina. - El microorganismo una vez aislado puede ser identificado
rápidamente. - También es posible usar la prueba de Quellung con
Ac específicos para identificar presuntivamente los
microorganismos presentes en secreciones respiratorias y
LCR.
Prueba de Quellung (Hinchamiento de la
cápsula)
- Si hay suficientes microorganismos en el preparado
teñido, puede efectuarse una identificación
confirmadora de Haemophilus influenzae tipo b usando la
prueba de Quellung.
Procedimiento.
- Se mezcla una gota de Antisuero para Haemophilus
influenzae, una gota de la muestra en un portaobjeto y una
gota de azul de metileno al 3%. - Si se desea se prepara un control negativo (una gota de
la muestra con azul de metileno al 3% y sin Antisuero) en el
mismo portaobjeto.
- Se colocan cubreobjetos sobre cada preparado y
después de 10 minutos a temperatura ambiente, se
examinan. - Se debe ajustar la iluminación, cerrando el
condensador. - Presentan una aparente "tumefacción" que se
debe a la formación de un complejo Ag-Ac en la
superficie del microorganismo, lo que causa un cambio en el
índice de refracción de la cápsula y una
"tumefacción" aparente. - Un resultado positivo de la prueba de Quellung
confirma la identificación de Haemophilus
influenzae tipo b. - Otros microorganismos a los que se les puede
practicar la prueba son: Streptococcus pneumoniae y
Neisseria meningitidis.
PRUEBA RÁPIDA DE
PRODUCCIÓN DE BETA-LACTAMASAS.
- Alrededor De un 10% de los aislamientos de
Haemophilus recuperados en laboratorios clínicos es
resistente a la ampicilina por la producción de las
beta-lactamasas. Esta característica está ligada
a plásmidos y puede transferirse de cepas resistentes a
cepas sensibles. - La beta-lactamasa es una enzima extracelular
producida por muchas cepas de bacterias que
específicamente hidroliza la unión amida en el
anillo b-lactámico de análogos de penicilina, con
lo cual el antibiótico resulta inactivo. - Se usan dos pruebas para la detección de
ácido peniciloico en el medio de la prueba:
Método capilar y Método
yodométrico. - El método capilar depende de:
- Un cambio de color del indicador rojo de fenol que
señala el cambio de pH. - El método yodométrico depende
de: - la capacidad del ácido peniciloico de reducir
yodo a yoduro, lo que da como resultado una decoloración
del complejo azul de yodo y almidón.
Método Capilar.
- Se sumergen tubos capilares en la solución de
prueba de penicilina y rojo de fenol. - Se deja que los tubos se llenen por acción capìlar hasta una distancia
de 1 a 2 cm. - Se raspan suavemente varias colonias de Haemophilus
influenzae crecidas en la superficie de una placa de agar,
formando un tapón bacteriano en el fondo del
tubo.
Prueba de la beta-lactamasa en tubo
capilar. El desarrollo de un color amarillo
cerca de la parte superior del tubo, en la zona de
inoculación bacteriana, indica la producción de
ácido peniciloico por destrucción del anillo
beta-lactámico de penicilina por acción de la
beta-lactamasa.
- Debe tomarse la precaución de que no quede
aire
atrapado entre la solución de prueba y las
bacterias. - Se incuban a temperatura ambiente en posición
vertical. - Si el microorganismo produce b-lactamasa, la
solución se torna amarillo brillante en 5-15
minutos. - Los microorganismos negativos no producen cambios en
el medio o sólo producen un tinte rosado.
Método
yodométrico
- Se inocula agar de Levinthal modificado con un cultivo
puro de microorganismo en estudio y se incuba a 35 grados
C. - Se suspende una asada de inoculación del crecimiento
bacteriano en la mezcla de buffer-penicilina hasta obtener
alrededor de 109 células
(Standard de MacFarland).
- Después de una hora de incubación a
temperatura ambiente. - Se agregan 2 gotas del indicador de almidón y
se mezcla. Se agrega una gotita de solución de yodo y se
mezcla. - Rápidamente se desarrolla un color azul
inicial debido a la reacción del yodo con el
almidón. - Se gira la mezcla durante 1 minuto.
- La persistencia del color azul durante más de
10 minutos constituye una prueba negativa. - La rápida decoloración del medio indica
que se ha formado ácido peniciloico y representa una
prueba positiva.
K y L
Tiras de papel filtro impregnadas con sustrato
penicilina-almidón y 2 gotas de reactivo de yodo. Los
organismos que producen beta-lactamasa son capaces de reducir el
yodo a yoduro incoloro, creando áreas de
decoloración del complejo yodo-almidón al aplicar
las colonias directamente a las zonas reactivas.
Obsérvense las reacciones positivas en las manchas de la
derecha, en comparación con los controles negativos de la
izquierda.
TINCIÓN DE GRAM Y AZUL DE METILENO
Puede hacerse un diagnóstico presuntivo y rápido de
infección por Haemophilus influenzae por medio del
exámen directo del material clínico adecuado usando
estas tinciones.
- Si se recibe suficiente muestra debe centrifugarse antes
del exámen en caso que fuese LCR. - Se coloca una gota de la muestra en un portaobjeto de
vidrio
limpio. - Se fija con calor y se
efectúa la tinción de Gram.
- Se observan como pequeños cocobacilos
Gramnegativos pálidamente teñidos. - Hacer un frotis simultáneo teñido con azul
de metileno. - Con esta tinción las bacterias se ven como
cocobacilos azul negro contra un fondo azul-gris
claro.
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Gram stain of Haemophilus
influenzae from sputum
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SEROTIPIFICACION DE HAEMOPHILUS
INFLUENZAE
- La técnica más sensible, rápida y
económica para la tipificación y aislamiento es
la aglutinación en portaobjetos.
- También se dispone de una prueba confirmadora con
cultivo y coaglutinación.
DETECCIÓN DE ANTÍGENOS CAPSULARES TIPO B
- Para establecer un diagnóstico rápido de
infección sistémica por Haemophilus tipo b, se
dispone de varias técnicas para la detección
del Ag de polirribosa-ribitol-fosfato de tipo b en LCR, suero
y orina. Estas técnicas comprenden: - Contrainmunoelectroforesis (CIE)
- Aglutinación con látex y
coaglutinación de proteína A - Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas
(ELISA) - Se Dispone comercialmente de pruebas de
aglutinación con látex y coaglutinación
para la detección de Ag de H. influenzae tipo b en
líquidos corporales y se usan ampliamente en
laboratorios. - En estos sistemas,
Ac contra Ag capsular de polirribosa-ribitol-fosfato de los
microorganismos tipo b se unen a partículas de
látex o células estafilocócicas.
- La mezcla de los líquidos corporales apropiados
con estos reactivos da como resultado una aglutinación
visible de segundos a minutos. - La técnica de ELISA también es sensible
para detectar el Ag en líquidos corporales. - En este método los Ac se unen a los pocillos de
plástico de una bandeja para
microtitulación. - Se coloca el líquido sospechoso de contener el Ag
en los pocillos y el preparado se incuba para permitir la
formación de complejos Ag-Ac. - Después del lavado de los pocillos para eliminar
material no unido. - Se agrega a la mezcla un conjugado de enzimas-anticuerpos
antihumanos específico. - Después de la incubación y el lavado.
- Se agrega el sustrato enzimático y la
reacción de color se lee con un
espectrofotómetro. - La intensidad de la reacción de color es
directamente proporcional a la cantidad de Ag unido.
Son susceptibles a la
ampicilina.
Susceptibles al cloranfenicol
cefalosporina
Sensibles a penicilina G,
eritrobicina o azitromicina
Bailey Scott
Diagnóstico Microbiológico
Editorial Médica Panamericana
Séptima Edición, Buenos Aires,
Argentina.
Miguel Torres
Manual Práctico de Bacteriología
Médica
Editorial Serviprensa C.A
Guatemala, Guatemala
1,999
Organización Mundial de la Salud
Métodos Básicos de Laboratorio en
Bacteriología Clínica
Ginebra, Suiza 1,993
Koneman
Diagnóstico Microbiológico Editorial
Médico Panamericano
Montevideo .R.O DE Uruguay
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www.monografias.com
Karla Rodríguez