Indice
1.
Métodos de separación.
Introducción
2. Los métodos
cromatográficos
3. Electroforesis
Convencional
4. Electroforesis Capilar
(CE)
5.
Bibliografía
1. Métodos de
separación. Introducción
Desde el siglo pasado las separaciones analíticas
se llevaban a cabo por métodos clásicos como son la
precipitación, destilación y extracción. Los
crecientes esfuerzos por conocer más sobre la
composición y función de
las proteínas
han obligado a los científicos a buscar técnicas,
cada vez, más precisas.
Para elegir una técnica de separarción,
además de tener en cuenta los criterios económicos
y de accesibilidad, hay que atender a dos tipos de
consideraciones: unas tienen que ver con las propiedades
físicas y estructurales de las moléculas que se
pretende separar, o de las características de la matriz en que
se encuentran; otras se derivan de los objetivos del
análisis (sensibilidad, resolución,
tiempo de
análisis, necesidad de una detección
específica).
El método de
selección incluye los pasos necesarios para
la obtención, preparación y posible fraccionamiento
de la muestra, la
aplicación de la técnica analítica adecuada
y el tratamiento de los datos
obtenidos.
Las técnicas analíticas más empleadas en la
actualidad pueden englobarse en dos grandes grupos:
técnicas de separación y técnicas
espectroscópicas. Las técnicas
espectroscópicas proporcionan, para cada compuesto
analizado, una información compleja, relacionada con sus
características estructurales específicas, por otro
lado las técnicas de separación se utilizan para
resolver los componentes de una mezcla y la señal obtenida
puede utilizarse con fines analíticos cuantitativos o
cualitativos.
Es precisamente en las técnicas de separación en
las que basaremos la revisión bibilográfica del
presente trabajo, debido a su amplio uso en el campo de la
Biotecnología, Biología Molecular y
Bioquímica
entre otras ramas de la investigación.
Actualmente las separaciones analíticas se realizan
fundamentalmente por cromatografía y electroforesis.
La cromatografía comprende un conjunto importante y
diverso de métodos que permite a los científicos
separar componentes estrechamente relacionados en mezclas
complejas, lo que en muchas ocasiones resulta imposible por otros
medios. Se
pueden separar moléculas en función de sus cargas,
tamaños y masas moleculares. También a
través de la polaridad de sus enlaces, sus potenciales
redox, etc.
La cromatografía no solo permite la separación de
los componentes de una mezcla, sino también su
identificación y cuantificación. El análisis
cualitativo está basado en la medida de parámetros
cromatográficos (tiempos y volúmenes de
retención) mientras que el análisis cuantitativo
está basado en la medida de alturas o áreas de
picos cromatográficos que se relacionan con la
concentración. La columna cromatográfica y la forma
con la que se diseña, constituye el corazón de
la separación. El detector, situado al final de la columna
es el que garantiza la respuesta de los componentes que se
separan.
En todas las separaciones cromatográficas la muestra se
desplaza con una fase móvil, que puede ser un gas, un
líquido o un fluido supercrítico. La fase
móvil puede pasarse a través de una fase
estacionaria, con la que es inmiscible y que se fija a una
columna o a una superficie sólida. Las dos fases se eligen
de forma, que los componentes de la muestra se distribuyen de
modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria.
Aquellos componentes que son fuertemente retenidos, por la fase
estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase
móvil; por el contrario los componentes que se unen
débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez.
Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la
muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden
analizarse cualitativa y/o cuantitativamente. Estos resultados se
recogen en forma de gráficos llamados cromatogramas.
Los métodos cromatográficos se pueden clasificar
según la forma en que la fase móvil y la fase
estacionaria se pongan en contacto. Así en la
cromatografía de columna, un tubo estrecho contiene la
fase estacionaria a través de la cual se hace pasar la
fase móvil por presión.
En la cromatografía en plano, la fase estacionaria se fija
sobre una placa plana o a los intersticios de un papel; en este
caso la fase móvil se desplaza a través de la fase
estacionaria por capilaridad o por gravedad.
Las tres clases de cromatografía desde un ángulo
más general son cromatografía de líquidos,
cromatografía de gases y
cromatografía de fluidos supercríticos. Como su
nombre lo indica, la fase móvil en las tres
técnicas son líquido, gas y fluido
supercrítico respectivamente.
Solo la cromatografía de líquidos es la que puede
llevarse acabo en columna o sobre superficies planas, por otra
parte tanto la de gas como la de fluidos supercríticos
están restringidas a los procedimientos en
columna de tal manera que las paredes de la columna contienen la
fase móvil.
La técnica más usada es la cromatografía
líquida de alta resolución, HPLC por su
sensibilidad, fácil adaptación a las
determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la
separación de especies no volátiles o
termolábiles y su aplicación a sustancias de
primordial interés en
la industria,
como son los aminoácidos, proteínas, ácidos
nucleicos, hidrocarburos,
carbohidratos,
entre otros. Se ofrece a continuación un esquema relativo
a este método de separación:
2. Los métodos
cromatográficos
La cromatografía líquida la podemos
diferenciar en cuatro grupos:
- C. de reparto: separa los solutos basándose en
la solubilidad - C. de adsorción: se basa en la afinidad de
adsorción - C. de exclusión: separa solutos según
el peso molecular - C. de intercambio iónico: separa solutos
según la carga iónica
Cromatografía de reparto
La cromatografía de reparto está formada por la
cromatografía Líquido-Líquido y la
cromatografía unida químicamente. Estas
técnicas se diferencian en la forma en que se retiene la
fase estacionaria sobre las partículas del soporte
relleno. En el segundo caso, como su nombre lo indica, la fase
estacionaria se une químicamente a la superficie del
soporte. Esta técnica actualmente es más usada
debido a que la cromatografía
líquido-líquido necesita de un recubrimiento
periódico de las partículas del
soporte debido a la pérdida de la fase estacionaria por
disolución en la fase móvil.
En general los soportes para casi todos los rellenos de fases
unidas químicamente se preparan con sílice
rígida o composiciones donde la sílice es el
elemento básico. Estos sólidos están
formados por partículas mecánicamente resistentes,
porosas y uniformes.
Los rellenos de columna en la cromatografía de fase unida
químicamente se clasifican como de fase inversa cuando el
recubrimiento enlazado tiene carácter
no polar, y de fase normal cuando el recubrimiento contiene
grupos funcionales polares.
Esta técnica puede utilizarse en la separación de
mezclas edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas,
bebidas refrescantes entre otras.
Cromatografía De Adsorción
La cromatografía de adsorción o
Líquido-Sólido es la forma clásica de la
cromatografía de líquidos. Ha sufrido algunas
transformaciones que la han convertido en un método
importante de la HPLC.
Las únicas fases que se utilizan en este tipo de
cromatografía son la sílice y la alúmina,
siendo la primera la preferida.
Es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas
moleculares inferiores a 5 000. Los métodos de la
cromatografía de adsorción y reparto tienden a ser
complementarios, aunque en algunos casos se superponen.
En general la cromatografía Líquido-Sólido
es más adecuada para muestras que son solubles en
disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en
disoluciones acuosas que son las que se utilizan en
cromatografía de reparto en fase inversa. En este tipo de
cromatografía también se pueden separar compuestos
con diferentes grupos funcionales. Una característica
particular de este método es su capacidad para diferenciar
compuestos isómeros en mezclas.
Cromatografía De Exclusión
La cromatografía de exclusión, también
llamada de filtración en gel o cromatografía de
permeación en gel, se basa en la diferencia de
penetración de las moléculas en los poros de la
fase estacionaria debido a que la separación obtenida
depende del tamaño de la molécula. El tiempo de
elución es proporcional al peso molecular de los mismos,
por lo que no es muy usada con los compuestos de alto peso
molecular. Este tipo de separación por tamaño
difiere de las demás técnicas de
cromatografía en que no existen interacciones
físicas o químicas entre el analito y la fase
estacionaria. Es una técnica reproducible, escalable y
rápida.
La fase fija está formada por partículas
poliméricas o de sílice que contienen una red uniforme de poros
por los que pueden penetrar las moléculas de
pequeño tamaño. Las moléculas de
tamaño grande se excluyen totalmente y son eluidas en
primer lugar, mientras que las de pequeño tamaño
tienen acceso a todo el volúmen poroso y son las
últimas que se eluyen; de esto se deduce que el
volúmen disponible para las moléculas
pequeñas es mayor que para las grandes. Por lo tanto las
moléculas se eluyen por su tamaño decreciente. En
resumen los factores que determinan la separación de las
moléculas son el tamaño del poro, el tamaño
de la partícula y el flujo de elución.
Los diferentes tipos de partículas usadas deben ser
estables, mecánica y químicamente, tener bajo
contenido en grupos iónicos, uniformidad de poro y
tamaño. Los compuestos pueden ser derivados de dextranos
(Sephadex), derivados de agarosa (Sepharosa), derivados de
acrilamidas (Biogel P) y esferas de vidrio. Hay
diferentes tamaños de partícula para un gel: a
menor tamaño mayor resolución y menor gasto en la
columna.
Este técnica se emplea en la separación de
proteínas de alimentos,
determinación de glucosa y fructosa en zumos de fruta,
etc.
Cromatografía De Intercambio Iónico
La cromatografía de intercambio iónico está
basada en la atracción entre iones del soluto y puntos
cargados que existen en la fase estacionaria. En el caso de
intercambiadores aniónicos, grupos cargados positivamente
en la fase estacionaria atraen aniones del soluto. Los
intercambiadores catiónicos contienen puntos cargados
negativamente que atraen cationes del soluto.
Los intercambiadores iónicos se clasifican en
ácidos o básicos, fuertes o débiles. Las
resinas ácidas fuertes siguen ionizadas incluso en
disoluciones muy ácidas, en cambio las
resinas ácidas débiles se protonan a un pH
próximo a 4 y pierden su capacidad de intercambio
catiónico. Los grupos muy básicos de amonio
cuaternario siguen siendo catiónicos a cualquier valor de pH.
Los básicos débiles de amonio terciario se
desprotonan en disoluciones moderadamente básicas y
pierden entonces su capacidad.
Las resinas de intercambio iónico tienen aplicación
en estudios donde intervienen moléculas pequeñas
(PM=500) que pueden penetrar en los poros pequeños de la
resina. Los intercambiadores iónicos de poliestireno son
tan grandes que las macromoléculas muy cargadas, como las
proteínas, se pueden enlazar irreversiblemente a ellos.
Los de celulosa y dextranos sirven para intercambio iónico
de macromoléculas. Los geles de intercambio iónico
se usan en el caso de moléculas grandes (proteínas
y ácidos nucleicos). Cuando las separaciones exigen
condiciones químicas fuertes se emplean intercambiadores
iónicos inorgánicos.
En resumen la gran variabilidad de los métodos
cromatográficos se debe a las diferentes condiciones que
pueden utilizarse para separar los componentes de una
sustancia.
Todas estas técnicas tienen en común la existencia
de una fase estacionaria a través de la cual fluye una
fase móvil, así como la presencia de un mecanismo
de inyección de la muestra y un mecanismo de
detección de los diferentes componentes separados.
La electroforesis fue desarrollada por primera vez por el
químico sueco Arne Tiselius, merecedor del Premio Nobel en
1948 por sus trabajos realizados en esta esfera.
La electroforesis es una técnica analítica de
separación de fundamento cinético basada en el
movimiento o
migración de las macromoléculas
disueltas en un determinado medio (solución tampón
de electroforesis), a través de una matriz o soporte
reticulado como resultado de la acción de un campo
eléctrico. El comportamiento
de la molécula viene dado por su movilidad
electroforética y ésta por la carga, tamaño
y forma de la misma. Cuanto mayor es la relación
carga/tamaño más rápido migra un ión
en el seno del campo eléctrico.
Esta técnica tiene como ventaja su capacidad de separar
macromoléculas de interés en la industria
biotecnológica y química. Ha sido un
método muy útil para la separación de
proteínas (enzimas, hormonas) y
ácidos nucleicos (DNA y RNA) con gran
resolución.
En un sistema
electroforético pueden originarse distintos
fenómenos que afectan la separación de las
sustancias:
- Difusión
Este fenómeno es provocado por la existencia de
gradientes de concentación que favorecen el transporte
hacia las zonas de menor concentaración de cada especie.
Afecta tanto a partículas cargadas como no cargadas. Las
moléculas tienden a moverse de una forma aleatoria debido
a que poseen energía cinética propia. Esto es lo
que se denomina difusión. Con un aumento de la temperatura
aumentará la difusión por un incremento de la
energía cinética.
- Migración
Es el movimiento producido por una fuerza externa
que es impuesta al medio, en este caso, el campo eléctrico
y su intensidad.
- Flujo térmico
Al pasar una corriente
eléctrica a través de un sistema que origina
una resistencia dada,
se produce calor. Por
tanto el sistema electroforético no es isotérmico.
En general la fase líquida se mueve hacia las zonas de
menor temperatura, lo que origina un transporte de las
partículas de interés no debido a la
migración.
- Fricción
La fricción con el solvente dificultará el
movimiento (es decir, al moverse los solutos chocarán con
las moléculas del solvente que están en su camino),
lo que genera una fuerza que se opone al movimiento.
La suma de todos estos factores provoca que las moléculas
no migren de una manera uniforme, de modo que, si las
moléculas son colocadas en un cierto lugar de la
solución, los iones comenzarán a moverse formando
un frente cuya anchura aumentará con el tiempo. Para
reducir esta anchura podemos reducir el movimiento de las
moléculas empleando un medio que oponga más
resistencia a dicho movimiento.
Esta situación nos permite diferenciar dos métodos
electroforéticos:
- Electroforesis convencional
- Electroforesis capilar.
3. Electroforesis
Convencional
La electroforesis convencional ha sido utilizada durante
muchos años para separar especies complejas de elevado
peso molecular de interés biológico y
bioquímico. Las separaciones se llevan a cabo sobre una
capa delgada y plana o placa de un gel semisólido y poroso
que contiene un tampón acuoso en el interior de sus poros.
Esta será la sustancia encargada de ofrecer resistencia al
movimiento de las moléculas, controlando así su
migración uniforme.
Mediante esta técnica se pueden separar varias muestras
simultáneamente. Dichas muestras se depositan sobre el
gel, se aplica un potencial de corriente continua a través
del mismo durante un tiempo fijo. Cuando las separaciones se han
completado se interrumpe el paso de corriente y las especies
separadas se tiñen para visualizarse.
La electroforesis en gel es muy utilizada en la detección,
control de
pureza, caracterización, cuantificación (por
comparación con controles) así como
preparación y purificación (por extracción
de bandas desde el gel) de moléculas y fragmentos de DNA y
RNA.
Los geles que se emplean son geles tridimensionales de
polímeros ramificados que tienen los espacios entre
ramificación rellenos de líquido. Las redes de polímeros no
solo reprimen la convección sino que también
actúan como cribas que pueden retardar y hasta bloquear la
migración de los analitos poliméricos más
grandes. En cambio los iones pequeños pueden moverse
libremente a través de la estructura
porosa del gel. De este modo la electroforesis en gel tiene dos
mecanismos de separación: electroforesis, que separa por
la relación carga/tamaño y tamizado, que separa
mayormente por tamaño. Los geles más comunes son
agarosa y poliacrilamida.
La agarosa es un polímero derivado de un
polisacárido neutro, que gracias a su poder de
gelificación y propiedades físico-químicas,
lo han convertido en el soporte más común para
electroforesis en el área de Biología Molecular. La
poiliacrilamida es un polímero formado a partir de
acrilamida y N,N´ metilenbisacrilamida. La
concentración de ambos reactivos define el grado de
reticulación del gel.
Ambos geles tienen en común que adquieren la misma forma y
están prácticamente libres de cargas
iónicas. Esto es importante para evitar que la
disolución tampón se desplace por el gel cuando se
active el campo eléctrico.
A continuación se ofrece un esquema con los aditamentos
necesarios para realizar esta técnica de
separación:
Este tipo de electroforesis es ampliamente utilizado en la esfera
biotecnológica, aspecto este que se ha podido comprobar a
partir de los numerosos resultados que se encuentran en la
literatura
más actual.
Existen otros tipos de electroforesis en gel como son la
electroforesis en geles desnaturalizantes de agarosa,
electroforesis en campo pulsado y la electroforesis preparativa.
Estas técnicas no son de aplicación tan general
pero no por ello dejan de ser importantes.
4. Electroforesis
Capilar (CE)
La electroforesis capilar es una técnica
alternativa de la electroforesis convencional y surge debido a
que la velocidad de
separación y resolución de los compuestos mejora a
medida que aumenta el campo eléctrico aplicado. Esta
afirmación no nos permite aumentar el potencial, aun
sabiendo que existe una dependencia directa de éste con el
campo eléctrico. Esto se debe a que el calentamiento de
Joule aumenta hasta afectar la calidad de la
separación. Para solucionar esta dificultad es que se
realiza la electroforesis en un tubo capilar con un
diámetro interno inferior a 0,1 mm y una longitud de 50 cm
a 1 m. Esta técnica está representada en el
siguiente esquema:
El mecanismo de separación está basado en las
relaciones carga/masa de los analitos. Su utilidad
está en la separación de proteínas y
péptidos entre otras sustancias.
Entre las ventajas que ofrece la electroforesis capilar se puede
apuntar que da lugar a separaciones con volúmenes de
muestra extraordinariamente pequeños (de 0,1 a 10 nL), en
contraste con la electroforesis convencional en la cual se
emplean volúmenes de muestra en el orden de los µL,
con una elevada resolución y rapidez. Ofrece además
mayor facilidad y velocidad que la cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC).
Esta técnica elimina el problema de los solventes de la
HPLC, la toxicidad de los mismos y su costo, pues
emplea soluciones
acuosas en su gran mayoría con muy baja
concentración iónica, incorpora los principios de la
automatización a través de un
hardware creado
especialmente con un software altamente
optimizado, aunque la reproducibilidad en el análisis
cuantitativo es peor.
Como las especies separadas eluyen de uno de los extremos del
capilar, se pueden utilizar detectores cuantitativos como los
empleados en HPLC. Como resultado se obtiene un electroferograma
con picos característicos de cada compuesto separado. En
realidad ambas técnicas son complementarias al basarse en
mecanismos de separación diferentes.
Podemos diferenciar varios tipos de electroforesis
capilar:
La electroforesis capilar en gel combina la técnica de
electroforesis con la cromatografía de reparto. Permite la
separación en función de la migración
electroforética y también en función del
peso molecular de las muestras. Se lleva a cabo en una matriz
polimérica con estructura de gel poroso, cuyos poros
contienen una mezcla tampón donde ocurre la
separación. Estos geles están contenidos en un tubo
capilar. Los geles utilizados son también de agarosa y
poliacrilamida.
Electroforesis capilar de zona: es una de las técnicas
más importantes y más utilizada debido,
probablemente a su simplicidad y elevado poder de
separación. Está basada en la separación de
los analitos según la relación
carga/tamaño.
En esta técnica la composición del tampón es
constante en toda la zona de separación. El potencial
aplicado hace que los diferentes componentes iónicos de la
mezcla migren cada uno según su propia movilidad y se
separen en zonas que puedan estar completamente resueltas o
parcialmente solapadas. Entre las zonas completamente resueltas
hay huecos ocupados por el tampón. Su principal
inconveniente es que no permite separar los compuestos
neutros.
Enfoque isoeléctrico: la diferencia de los puntos
isoeléctricos de las proteínas se aprovecha para
separarlas por el método de isoelectroenfoque. Este
método se basa en establecer un gradiente de pH estable en
una disolución o gel. Este gradiente se establece por un
conjunto de tampones especiales llamados anfolitos que migran por
sí mismos hasta que alcanzan sus puntos
isoeléctricos. Cuando al gradiente de pH se le introduce
una proteína, cada zona intercambia protones con la
muestra proteica, generando una separación
isoeléctrica conocida como electroenfocado.
La isotacoforesis significa electroforesis a velocidad uniforme.
Esto significa que el tiempo de recorrido en el capilar bajo
condiciones isotacoforéticas es independiente de la
velocidad. Es una técnica de separación por
desplazamiento.
Antes de iniciar la corrida, el capilar se debe llenar con un
electrolito líder o
guía en un extremo. Este debe tener una gran movilidad y
debe ser mayor que la de los componentes a separar. Luego se
introduce la muestra seguida del electrolito terminal o cola,
cuya movilidad debe ser menor que cualquiera de los componentes
de la muestra. La selección de los electrolitos
guías y terminales depende del conocimiento
de los valores de
las movilidades y del pKa para todos los componentes de la
muestra.
En la isotacoforesis las bandas siempre están en contacto
con la zona adyacente. Esta característica es necesaria
para mantener la continuidad eléctrica a lo largo del
sistema, dado que no hay un electrolito de soporte.
Esta técnica puede ser utilizada para determinar cationes
y aniones. Se requiere usualmente corridas separadas para
determinar cada forma iónica.
La electrocromatografía capilar es un híbrido entre
la HPLC y la CE donde se reúnen algunas de las mejores
características de cada técnica por separado, por
lo que tiene ventajas sobre ellas. De esta manera la
electrocromatografía capilar puede usarse para la
separación de especies no cargadas. Proporciona una
elevada eficacia en las
separaciones de microvolúmenes de disolución de
muestra, sin necesidad de aplicar un bombeo de alta
presión.
En la electrocromatografía capilar la fase móvil se
transporta a través de la fase estacionaria por el bombeo
ejercido por el flujo electroosmótico y no por un bombeo
mecánico, lo que simplifica significativamente el
equipo.
Se diferencian dos tipos de electrocromatografía
capilar:
- Electrocromatografía rellena, en la cual un
disolvente polar se conduce por el flujo electroosmótico
a través de un capilar que contiene un relleno
típico de HPLC en fase inversa. Las separaciones
dependen de la distribución de los analitos entre la
fase móvil y la fase estacionaria líquida
retenida por el relleno. - Cromatografía capilar electrocinética
micelar. Esta técnica requiere la utilización de
un tensoactivo en un nivel de concentración en el cual
se formen micelas. Estas micelas son capaces de alojar
compuestos no polares en su interior. La interacción de
las micelas y los solutos es la que produce la
separación.
En resumen la cromatografía y la electroforesis
son en la actualidad técnicas ampliamente utilizadas en la
resolución de macromoléculas de interés en
la industria biotecnológica, biológica y
bioquímica. Muestra de ello es el numeroso grupo de
estudios realizados que se encuentra en la literatura
especializada.
Se destaca en las últimas décadas un mayor uso de
la electroforesis capilar. Esta versión instrumental de la
electroforesis convencional resulta más ventajosa debido a
los pequeñísimos volúmenes que se necesitan
para el estudio en cuestión y los resultados se obtienen
en un tiempo mínimo. Estos aspectos la hacen preferida
entre las técnicas de separación.
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Palabras clave: métodos de separación,
cromatografía, electroforesis
Autor:
Teresa Fernández Aldama
,
Marcelo Marcet Sánchez
,
Carlos Martin Medina
,
carlosmartin63[arroba]yahoo.com
Eugenio Carrillo Prieto
eugenio.carrillo[arroba]umcc.cu,
eugeniocarrillo2001[arroba]hotmail.com