Sistemas de modificación celular (página 2)

Partes: 1, 2

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La eficiencia de transfección depende de la superación de varias barreras:
adsorción del complejo de transfección en la superfície celular y entrada del complejo en la célula (membrana plasmática)
liberación del ADN del endosoma y escape a la degradación lisosomal
translocación a través de la membrana nuclear y entrada en el núcleo
Barreras que tiene que superar el ADN
http://www.nano-lifescience.com/research/gene-delivery.html

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1. Métodos químicos
Coprecipitación con fosfato cálcico:
precipitado de complejos fosfato cálcico-ADN que son endocitados por la célula

ADN + CaCl2

Añadir Na2PO4 en tampón

Precipitados de CaPO4 con ADN

endocitosis

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1. Métodos químicos
DEAE-dextrano (dietilaminoetil-dextrano): complejos de polímeros DEAE-dextrano y ADN, se introducen por shock osmótico con DMSO o glicerol
Se utiliza solo en transfecciones transitorias.

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1. Métodos químicos
Lípidos catiónicos: los liposomas catiónicos se acomplejan con el ADN y al fusionarse con la membrana celular, facilitan la entrada del ADN a través de endosomas
Este método recibe el nombre de Lipofección

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Protocolo de Lipofección

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1. Métodos químicos
Lípidos catiónicos: Alta eficiencia de transfección y baja toxicidad en determinados tipos celulares
Gen marcador: ?-galactosidasa

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1. Métodos químicos
PEI (polyethylenimine): Es un polímero catiónico sintético que genera complejos con el ADN. Estos complejos interaccionan con los proteoglicanos aniónicos de la membrana y entran por endocitosis

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1. Métodos químicos
PEI
Lípidos catiónicos
Comparación entre dos métodos de transfección en células HEK293
Gen marcador: GFP (green fluorescent protein)

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DNA transfection of various cell lines, including CHO-K1, COS-7, NIH3T3, HeLa S3, with CellLine Transfection Reagent
1. Métodos químicos
Comparación de la eficiencia de la lipofección entre distintas líneas celulares

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Factores que pueden influir en la eficiencia de Transfección
Presencia de antibióticos
El complejo puede interaccionar con el antibiótico disminuyendo la eficacia y aumentando la toxicidad

Presencia de suero
El suero puede disminuir la eficiencia de transfección
Aunque la ausencia de suero puede hacer el liposoma más tóxico para las células

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2. Métodos físicos
Microinyección: consiste en la inyección directa del ADN al citoplasma o núcleo de la célula

Biolístico (biological ballistics): implica la introducción de micropartículas de tungsteno u oro recubiertas con ADN con una pistola de helio.

Electroporación: se basa en la generación de un shock eléctrico corto que origina pequeños orificios a la membrana que permiten la entrada del ADN. Elevada eficiencia, pero también elevada muerte celular

Magnetofección: utiliza nanopartículas magnéticas para facilitar la entrada del ADN en las células

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Microinyección
Introducción de soluciones de macromoléculas mediante capilares finos de vidrio que se manipulan bajo un microscopio.

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Microinyección
Limitaciones
Dificultad técnica (requiere personal y instrumentación especializados)
Manipulación individualizada de las células (elevado consumo de tiempo)
Seguimiento individual de cada célula microinyectada

Aplicaciones más corrientes:
Microinyección de células adherentes en cultivo
Generación de animales transgénicos (microinyección de ADN en el pronúcleo masculino del zigoto)
Fecundación in vitro de oocitos (inyección de esperma en el citoplasma del oocito)

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Biolistic particle delivery
Método de transfección mediante bombardeo de las células con micropartículas de oro o tungsteno recubiertas con ADN o ARN.
Helios Gene Gun – BioRad
Aplicaciones:
Recomendado para células resistentes a otros métodos y especialmente para células vegetales

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Electroporación
Introducción de macromoléculas en las células mediante la exposición a un pulso eléctrico de elevada intensidad y corta duración que provoca la apertura de poros en la membrana plasmática.
Ventajas:
Técnica simple, reproducible y de gran eficacia

Desventajas:
Requiere desenganchar las células del sustrato
Mucha mortalidad celular
Se tienen que ajustar las condiciones para cada tipo celular

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Electroporación
Parámetros:
Amplitud del pulso (Voltaje en kV/cm)
Longitud del pulso (de ?seg a mseg)

Normalmente las condiciones que permiten una mayor eficiencia de transfección provocan una muerte celular de entre el 40 y el 60%

En la actualidad existen también sistemas de electroporación para células adheridas al sustrato y para realizar electroporaciones in vivo.

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MagnetofecciónMATra – Magnet Assisted Transfection
Utilización de nanopartículas magnéticas para mejorar la entrada de biomoléculas, como el ADN, dentro de las células.

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Transfección transitoria: expresión de la proteína exógena durante un período corto (1 a 4 días). El ADN no se integra en el genoma de la célula.
Transfección estable: permite la expresión de la proteína indefinidamente (en teoría). Se consigue mediante la selección de los clones que hayan incorporado el plásmido en su genoma (Tasa de inserción= 1 célula de cada 10000).
Tipos de transfección
http://www.promega.com/guides/transfxn_guide/transfxn.pdf

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Ventajas
Elevado nivel de expresión
Es fácil co-expresar varias proteínas
Procedimiento fácil y rápido
Ventajas
Población celular homogénea (clonal)
Producción continua de proteína (teóricamente)
Almacenamiento de células expresoras del transgen
Transfección transitoria vs. Transfección estable
Transfección transitoria
Transfección estable
Inconvenientes
Variabilidad en el porcentaje de células expresoras (población celular heterogénea)
Obtención de poca cantidad de proteína (producción temporal)
Requiere gran cantidad de plásmido
Inconvenientes
Integración del transgen al azar en el genoma celular
Niveles de expresión moderados
Es complicado obtener la co-expresión de varias proteínas
Procedimiento laborioso y largo de selección clonal

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1/10000 céls.
Colonias de células estables
Se tripsinizan individualemente
Se cultivan y amplifican para testar y caracterizar la expresión del gen
Transfección
Adición antibiótico
1 mes
2 días
1-2 semanas
Muerte masiva células no estables
2 semanas
2 meses
Clones estables: procedimiento de obtención

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Sin selección
muerte de células no expresoras
crecimiento de los clones estables
Cassettes de resistencia:
NEO: Selección con G418 (0.1-1.0 mg/ml)
HYG: Selección con Higromicina-B (10-300 mg/ml)
PAC: Selección con puromicina (0.5-5 mg/ml)

Estos antibióticos actuan inhibiendo la síntesis proteica
Clones estables: selección con antibiótico
Con selección
aparición de clones resistentes

Sistemas de modificación celular
SubIntroducción
Genes marcadores
Técnicas de introducción de ADN en las células animales en cultivo
Transfección
Métodos químicos
Métodos físicos
Establecimiento de líneas de expresión estable
Transducción: vectores virales
Adenovirus
Retrovirus y Lentivirus
Métodos de introducción de proteínas

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Transducción: vectores virales
Adenovirus
Retrovirus
Lentivirus
Herpes virus
Adeno-associated virus

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Vectores virales: Adenovirus
Grupo de virus benignos, baja patogenicidad (ej. resfriado común)
Genoma: ADN de doble cadena linear con una proteína unida covalentemente al extremo 5’ (TP: terminal protein). Longitud aprox. 36 kb
Simetria icosahédrica (80-100 nm diámetro)
Proteínas de la cápside: Hexon, penton base, fibra globular

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Vectores virales: Adenovirus
Ciclo del Adenovirus

Entran mediante la unión (alta afinitat) a receptores específicos de la célula diana mediada por el extremo globular de la fibra
Endocitosis del virus
Sale del endosoma y transloca al núcleo
El ADN viral entra en el núcleo y empieza la transcripción
La transcripción, la replicación y el empaquetado tienen lugar dentro del núcleo de la célula infectada.

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Vectores virales: Adenovirus
Genoma del Adenovirus

Se transcriben las dos cadenas de ADN

Transcripción en dos fases:
Early: E1, E2, E3 i E4 (antes de la replicación del ADN)
Late: (después de la replicación del ADN)

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Vectores virales: Adenovirus
Vector Adenoviral

Virus deficientes en la replicación- deleción de las regiones E1 (esencial para la replicación) y E3 (modulación respuesta immune huésped).
El inserto puede ser de 7 a 8 kb (gene-X)
Empaquetado en una línea celular que proporciona los productos de E1 y E3 en trans (normalmente HEK293)

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Vectores virales: Adenovirus
Ventajas
Infectan un amplio rango de células de mamífero con elevada eficiencia
Infectan tanto células en división como células que no se replican
Elevados niveles de expresión de la proteína
Se pueden obtener adenovirus en gran cantidad (adecuado para terapia génica)
El ADN no se integra en el genoma por lo tanto no produce mutagénesis (epicromosómico)
Se pueden utilizar en cultivos en suspensión (producción de proteína a gran escala)
Sistema homólogo para genes humanos

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Vectores virales: Adenovirus
Inconvenientes
Limitación en el tamaño del inserto (7-8 kb)
Expresión transitoria de la proteína

Aplicaciones
Transducción de ADN en células de mamífero para estudios de funcionalidad de proteínas
Obtención de proteína recombinante por sobre-expresión en células humanas
Terapia génica “in vivo”

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Oncoretrovirus (retrovirus)
ej. Moloney Murine Leukemia Virus
Sólo infectan células en división

Lentivirus
ej. HIV
Infectan tanto células en división como quiescentes
Retrovirus

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Vectores virales: Retrovirus
Dos copias de ARN de cadena simple envuelto de proteína (ssRNA)
Codifica por una transcriptasa reversa (RTase: RNA-dependent DNA polymerase)
Sólo infecta a células en división
Se integra en el genoma de la célula

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Vectores virales: Retrovirus
Ciclo del retrovirus
Infección célula diana
Genoma RNA ? copia DNA ? transporte al núcleo
Integración del ADN al cromosoma
Transcripción DNA viral ? mRNA
Traducción mRNA ? gag, pol, env
Formación cápside: empaquetamiento de mRNAs/RTase
Partículas virales liberadas

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Vectores virales: Retrovirus
Construcción Vector Retroviral
¿Qué es imprescindible?
5’ LTR (promotor) y 3’ LTR (polyA)
señal de empaquetamiento

No se necesita:
gag, pol, env
estas proteínas las puede proporcionar la línia celular utilizada
para la producción de los viriones

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Vectores virales: Retrovirus
(Gp:) Promotor

Gag- proteínas estructurales internas de la cápside
Pol- Rtase, integrasa, proteasa
Env- proteínas de la cápside
(Gp:) Genoma retroviral

(Gp:) Vector retroviral
(Gp:) Promotor

Tamaño máximo del inserto ? 8kb

Construcción Vector Retroviral

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Vectores virales: Retrovirus
Obtención de los Retrovirus
Línea celular empaquetadora
Producción de los retrovirus

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Vectores virales: Retrovirus
Ventajas:
Expresión estable de la proteína (integración del ADN al genoma)
Puede infectar células de distintas especies (insectos, amfibios, peces, aves, mamíferos)

Inconvenientes:
Limitación tamaño inserto ( 8 kb)
Dificultad de producción a gran escala de los retrovirus
No infecta células que no se repliquen
La inserción del ADN al genoma puede producir mutagénesis insercional

Aplicaciones:
Introducción de ADN en células en cultivo para obtener expresión estable
Terapia génica “ex vivo”

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Lentivirus

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Métodos de transfección de péptidos, proteínas o anticuerpos
Microinyección
Electroporación
Lípidos catiónicos
BioPorter® (Genlantis)
Pro-Ject (Pierce)
“Carriers” de composición desconocida:
Chariot? (Active Motif)
ProteoJuice ? (Novagen)
TransPass™ P (New England Biolabs)
BioTrek™ Protein Delivery Reagent (Stratagene)

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Aplicaciones
Estudiar la función de la proteína introducida
Inhibir la actividad de una proteína celular endógena
Analizar la distribución subcelular de la proteína introducida
Realizar inmunodetección de proteínas en células vivas

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BioPORTER? Reagent
www.genetherapysystems.com

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Pro-Ject Protein Transfection Reagent
http://www.piercenet.com/
Efficient protein delivery in hours instead of days. This is a unique cationic lipid mixture which, when complexed with proteins or peptides, allows direct intracellular delivery of proteins, peptides, antibodies and other biologically active molecules. Pro-Ject Protein Complexes attach to negatively charged cell surfaces and either can directly fuse with the membrane and deliver the captured protein into the cell or be endocytosed by the cell and then fuse with the endosome, releasing the captured protein into the cytoplasm (Figure 1). Since the complex formed is noncovalent it does not interfere with the protein's biological activity.

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Chariot™
simple, efficient protein delivery
Chariot™* is a revolutionary delivery reagent that quickly and efficiently transports biologically active proteins, peptides and antibodies directly into cells. The typical delivery efficiency is 60-95%. Less than two hours after delivery, live cells can be assayed to determine the effects of the introduced material, without the need for fixing. This makes Chariot an ideal tool for functional studies, including delivering inhibitory proteins, labeling organelles, screening peptide libraries and studying protein half-lives & transient complementation.

The Chariot™ Advantage
Works in a variety of cell lines
Facilitates functional studies in living cells — no fixing required
Works in vivo (1)
Fast and efficient — 60-95% transfection in less than 2 hours
No need for expression of fusion proteins
Non-cytotoxic, serum independent